Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Shubhendu Sen Roy; Huy Cong Xuan Nguyen; Thomas A. Angelovich; Anna C. Hearps; Diana Huynh; Anthony Jaworowski; Theodoros Kelesidis

doi:10.3791/56325

JoVE Journal > Immunology and Infection

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İmmünoloji ve Enfeksiyon

Acellulaire biochimique dosage fluorimétrique pour haut débit mesure de peroxydation des lipides dans les lipoprotéines de haute densité

Published: October 12, 2017

doi:

10.3791/56325

Shubhendu Sen Roy¹, Huy Cong Xuan Nguyen¹, Thomas A. Angelovich^2,3, Anna C. Hearps², Diana Huynh^1,4, Anthony Jaworowski^2,4, Theodoros Kelesidis¹

¹University of California, Los Angeles, ²Centre for Biomedical Research,Burnet Institute, ³School of Health and Biomedical Sciences,RMIT University, ⁴Department of Infectious Diseases,Monash University

Özet

Nous décrivons ici un dosage fluorimétrique acellulaire biochimique pour dosage du HDL-la peroxydation lipidique. Ce test rapid et reproductible peut servir à déterminer la fonction de HDL dans les études à grande échelle et peut contribuer à notre compréhension de la fonction de HDL dans la maladie humaine.

Abstract

Les lipoprotéines de haute densité faible taux de cholestérol (HDL-C) est l’un des plus puissants prédicteurs négatifs indépendants d’athérosclérose cardiovasculaire (MCV). La structure et la fonction des HDL et non HDL-C peuvent prédire avec plus de précision l’athérosclérose. Plusieurs HDL protéines et lipides de compositions changements qui portent atteinte à la HDL se produisent dans les États inflammatoires telles que l’athérosclérose. Fonction de HDL est généralement déterminée par la cellule en fonction des tests comme le test de l’efflux de cholestérol, mais ces tests ont plusieurs inconvénients manque de normalisation. Dosages acellulaire peuvent accorder des mesures plus robustes de fonction de HDL par rapport aux analyses cellulaires. Oxydation de HDL altère la fonction de HDL. HDL a un rôle majeur dans le transport de peroxydes lipidiques et élévé de peroxydes lipidiques est liée à la fonction anormale de HDL. Les interactions lipide-sonde devraient considérer quelle interprétation des résultats de la fluorescence non enzymatique tests pour mesurer l’état d’oxydation lipidique. Cela a motivé nous développions une méthode enzymatique acellulaire biochimique pour évaluer des HDL peroxyde contenu lipidique (HDLox) qui contribue à la dysfonction de HDL. Cette méthode s’inspire de la peroxydase de raifort (HRP) de l’enzyme et le fluorochrome rouge Amplex qui permet de quantifier (sans oxydase de cholestérol) la teneur en lipides peroxydes par mg de HDL-C. Voici un protocole describedfor détermination de la peroxydation lipidique HDL utilisant le réactif de fluorochrome. Variabilité du dosage peut être réduite par une normalisation stricte des conditions expérimentales. HDLox des valeurs plus élevées sont associés à la fonction d’antioxydant HDL réduite. La lecture de ce test est associée de lectures d’essais basés sur les cellules validés, les mesures de substitution des maladies cardiovasculaires, l’inflammation systémique, dysfonctionnement immunitaire et phénotypes de risques cardiovasculaires et métaboliques. Cette approche technique est une méthode fiable pour évaluer la fonction des HDL dans la maladie humaine où l’inflammation systémique, le stress oxydatif et lipides oxydés ont un rôle clé (telles que l’athérosclérose).

Introduction

Les maladies cardiovasculaires athérosclérotiques (CVD) sont la principale cause de décès dans le monde¹^,². Les études épidémiologiques ont montré que les faibles niveaux de cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL) sont généralement inversement associés au risque pour le développement de l’athérosclérose¹^,². Bien que plusieurs études prend en charge un rôle atheroprotective HDL¹^,², le mécanisme par lequel les HDL atténue l’initiation et la progression de l’athérosclérose est complexe ³^,⁴. Ainsi, il a été suggéré que la structure complexe et la fonction de HDL au lieu du niveau absolu peuvent prédire avec plus de précision l’athérosclérose ⁵^,⁶^,⁷^,⁸. Plusieurs HDL protéines et lipides de compositions changements qui portent atteinte à la HDL se produisent dans les États inflammatoires telles que l’athérosclérose. Ces i) réduire son cholestérol efflux potentiels ⁹, ii) réduction anti-inflammatoires et augmentation des protéines pro-inflammatoires associées aux HDL ⁶^,⁷, niveaux de facteur d’antioxydants diminution iii) et de l’activité et de HDL capacité d’inhiber l’oxydation des lipoprotéines de basse densité (LDLox)¹⁰ et iv) augmenter les lipides hydroperoxyde contenu et redox activité (HDLox)⁹^,¹¹. Dosages robustes qui évaluent les fonctions pleotropic de HDL (par exemple l’efflux de cholestérol, fonction antioxydante) peuvent compléter le dosage du HDL-C-HDL dans la clinique.

La fonction de HDL est habituellement évaluée par des méthodes basées sur les cellules comme les efflux de cholestérol dosage⁸^,¹²^,¹³^,¹⁴. Ces méthodes ont des limites importantes, y compris une hétérogénéité significative en ce qui concerne les types de cellules utilisées, le type de lecture a signalé, l’absence de normalisation et effets confusionnels des triglycérides ⁷^,¹⁵. Ces inconvénients soulèvent des difficultés pour les grandes études cliniques¹⁶. Dosages acellulaire peuvent accorder des mesures plus robustes de fonction de HDL par rapport aux analyses cellulaires. L’efflux de cholestérol est l’une des fonctions plus importantes de HDL, mais il ne peut être déterminée par des analyses cellulaires. Autres approches pour déterminer la fonction de HDL comme protéomique¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,essais chimiotactisme sur les cellules monocytes de HDL fonction ¹⁷^,²²^,²⁵ et ²⁴ n’ont pas été normalisées et ne peut être utilisés dans les études chez l’homme à grande échelle.

HDL a important antioxydant atheroprotective effet⁵^,⁶^,⁷^,⁸. La fonction antioxydante de HDL a été déterminée en présence de LDL dans la précédente cellule dosages fluorimétrique libre ²⁶. Ces méthodes fluorimétrique biochimiques de la fonction antioxydante HDL ont été développées par Mohamad Navab et Alan Fogelman et leurs collègues²⁶. Bien que plusieurs études sur les humains ont utilisé ces méthodes pour déterminer les HDL fonction ¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³ ^,²⁴, lipides (HDL)-lipides (LDL) et les interactions lipide-fluorochrome peuvent limiter la reproductibilité de ces épreuves biochimiques non-enzymatique libre cellulaire du HDL fonction²⁷^,²⁸.

Intérêt récent a mis l’accent sur les conséquences fonctionnelles de l’oxydation de HDL qui est le résultat de l’oxydation des lipides et de protéines dans les HDL ²⁷^,²⁹^,³⁰. Des études antérieures ont démontré que l’oxydation du HDL altère HDL fonction ²⁷^,²⁹^,³⁰. HDL a un rôle majeur dans le transport de peroxydes lipidiques et élévé de peroxydes lipidiques est liée à la fonction anormale de HDL. Ainsi les teneur en peroxyde lipidique HDL peut être utilisée pour déterminer les HDL fonction ⁹^,¹⁷^,²⁰^,³¹ et étant donné les limitations connues des essais préalables de HDL fonction⁷^, ¹⁵^,²⁷^,³², nous avons développé une méthode fluorimétrique alternative qui quantifie les HDL lipides teneur en peroxyde (HDLox) ³². Cette méthode s’inspire de la peroxydase de raifort (HRP) de l’enzyme et le fluorochrome rouge Amplex qui permet de quantifier (sans oxydase de cholestérol) la teneur en lipides peroxydes par mg de HDL-C ³². Principe du dosage biochimique est montré dans la Figure 1. Nous avons montré que cette approche axée sur la fluorescence n’a pas les limites des tests de la fonction de HDL préalable²⁷^,²⁸. Ce test a été encore raffiné et standardisé dans notre laboratoire afin qu’il fiable peut être utilisé dans les études chez l’homme à grande échelle même avec cryoconservés plasma ³²^,³³^,³⁴^, ³⁵ ^, ³⁶ ^, ³⁷ ^, ³⁸ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴². la lecture de ce test est associée avec lectures d’essais basés sur les cellules validés, les mesures de substitution des maladies cardiovasculaires, l’inflammation systémique, dysfonctionnement immunitaire et phénotypes de risques cardiovasculaires et métaboliques ³² ^, ³³ ^, ³⁴ ^, ³⁵ ^, ³⁶ ^, ³⁷ ^, ³⁸ ^, ³⁹. nous décrivons ici, cette méthode simple mais robuste pour mesurer la teneur en peroxyde lipidique HDL (HDLox). Ce dosage peut servir comme un outil pour répondre à des questions de recherche importantes concernant le rôle de fonction de HDL dans la maladie humaine où l’inflammation systémique, le stress oxydatif et lipides oxydés ont un rôle clé (telles que l’athérosclérose)³².

Protocol

toutes les expériences à l’aide d’échantillons biologiques humains ont été effectués avec l’approbation de l’éthique de l’Université de Californie à Los Angeles, Los Angeles et le Comité de l’éthique humaine Alfred Hospital, Melbourne. Remarque : il existe de nombreuses variations de la fonction de fluorochrome HDL Assay (Voir discussion) 32. Ci-dessous, nous allons décrire le protocole qui donne des résultats plus cohérents et reproductibl…

Representative Results

50 µL de chaque échantillon de HDL sont ajoutés dans chaque puits comme au point 7.3. 50 µL de solution HRP 5 U/mL (0,25 U) sont ensuite ajoutés dans chaque puits comme à l’étape 7,5. Les échantillons sont incubés pendant 30 min à 37 ° C, comme dans l’étape 7,6. 50 µL de réactif de fluorochrome sont ensuite ajoutés dans chaque puits comme à l’étape 7,7 (concentration finale de 300 µM). L’affichage fluorescent (en foncé) est ensuite évalué chaque minute pendant…

Discussion

Le protocole décrit ici offre un outil robuste pour répondre à des questions de recherche importantes concernant le rôle de fonction de HDL dans l’athérosclérose et des maladies humaines. L’essai quantifie la teneur en peroxyde lipidique HDL par mg de HDL-C en utilisant l’amplification enzymatique (HRP). Cette approche évite les limitations connues de tests de fonction HDL préalables (par exemple l’essai de l’efflux de cholestérol) y compris une hétérogénéité significative en ce qui concerne les t…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient les travaux du Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman et Reddy Srinivasa pour leur rôle clé dans le développement d’itérations précédentes de ce modèle. T.A.A. est pris en charge par un RMIT University rectorale bourse postdoctorale. AJ et AH sont pris en charge par NHMRC projet grant 1108792. TK est pris en charge par NIH accorde NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # µL1TR000124.

Materials

Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent	Pointe Scientific	H7511
Amplex Red reagent.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
DMSO.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP)	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
Cholesterol Esterase.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
Cholesterol Reference standard	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standard	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
5x Reaction Buffer.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent	ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.	TR39601
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).	Sigma Aldrich	M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).	Sigma Aldrich	M9936
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150
ClipTip 200, sterile	ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.	14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125	ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.	14-387–955
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Software
Gen5 2.01 software	Biotek, Vermont, USA	NA
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Equipment
Gen5 Plate reader	Biotek, Vermont, USA	NA

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Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay High-throughput Lipid Peroxidation High Density Lipoprotein HDL Function Cardiovascular Disease Metabolic Abnormalities Inflammatory Diseases HDL-C HDLox Pooled Quality Control HDL Cholesterol Precipitating Reagent HRP Fluorochrome Reagent DMSO

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Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).