Évaluation des effets des composés sur le développement du réseau de neurones vertébrés fonction à l’aide de rangées d’électrodes multiples de perturbateurs endocriniens

Le protocole ci-dessous a été normalisé pour tester les effets de l’exposition au BPA durant l’embryogenèse (au début) et peut-être être modifié pour une utilisation avec BPS, BPF ou autre EDC en neurones embryonnaires de poussin. Ce protocole suit les politiques institutionnelles du Delaware State University et la politique des NIH pour les embryons aviaires. Le protocole est également en confirmation avec le matériel et les consignes de sécurité chimique du mémorandum d’accord. 1. matériau installation Dissoudre le BPA (m.w. 228.29) dans l’éthanol à 10 % (v/v) dans l’eau pour faire une solution mère de 1 mM (0,23 mg / mL d’éthanol à 10 %). Préparer des dilutions suivantes (0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM et 10 µM) dans un milieu neurobasal.ATTENTION : Le BPA est une toxine environnementale et il fallait être prudent lorsque vous manipulez la poudre. Incuber des oeufs de poulet dans un incubateur de œufs de table disponible dans le commerce à 37 ° C. Incuber les œufs pendant 7 jours pour les embryons de E7. Préparer mesure stériliser le nombre requis d’ame tremper dans de l’éthanol à 70 % pendant 3 à 4 h, puis rincer trois fois dans environ 10 mL d’eau distillée stérile dans la hotte BSLII.Remarque : L’Ame contient 64 électrodes de platine nanoporeux disposés dans une grille 8 x 8. Le diamètre de l’électrode est 30 µm et l’espacement entre les électrodes est de 200 µm. Ne pas utiliser de l’éthanol dénaturé pour stériliser l’Ame que cela conduira à la corrosion de l’Ame. Placer l’Ame à l’intérieur d’un contenant stérile avec couvercle (pour maintenir des conditions stériles) et passer à un incubateur de dessus de table. Cuire au four pendant au moins 6 heures à 55 ° C. Cette étape est cruciale pour une stérilisation adéquate et la température ne doit pas dépasser 60 ° C. Maintien de la stérilité, déplacez le plat contenant ame à la hotte BSLII pour le stockage avant réutilisation.Remarque : Nous utilisons un plat allant au four de verre sécurisé de four avec couvercle en plastique et surface il stériliser avec de l’éthanol à 70 % et place dans la hotte BSLII pour le séchage. Partie aliquote de la solution de la matrice extra-cellulaire mec. Décongeler le flacon à 4 ° C durant la nuit et geler 100 µL d’extraits à-20 ° C.Remarque : L’ECM est livré congelé. ECM pas devrait être ramené à température ambiante jusqu’au moment pour enduire car il polymérise à température ambiante et, une fois polymérisé, il est impossible de manteau. ECM sans facteurs de croissance est préférable pour éviter des effets supplémentaires en raison de facteurs inconnus. Stériliser tous les instruments de dissection (pinces Dumont #5, pince courbée, petits ciseaux et ciseaux de printemps) et documents auto-obturant enduit plats de dissection avec 70 % d’éthanol et laissez-les sécher dans la hotte de la dissection. 2. Culture de neurones embryonnaires chick et activité réseau Le jour de l’électrodéposition, retirer un flacon de ECM du congélateur-20 ° C, vaporiser avec l’éthanol à 70 % et placer sur la glace. Diluer à 25 % en ajoutant 300 µL de milieu neurobasal froid à l’intérieur de la hotte BSLII. En utilisant un P200 pipetteman ajouter 100 µL d’ECM de 25 % au centre de la MEA en prenant soin de ne pas toucher les électrodes et retirez immédiatement laissant une fine pellicule à la surface. Couvrir la MEA et placer dans un incubateur à CO2 (37 ° C et 5 % CO2) jusqu’au moment de la plaque les neurones. Stériliser la coque extérieure d’un oeuf de E7 (embryonnaire jour 7, incubée à 37 ° C pendant 7 jours) avec de l’éthanol à 70 %. Décapiter l’embryon dans un plat de dissection de fond Sylgard contenant froid stérile de Hank équilibré sels Solution (HBSS) sans calcium. Coupez autour des yeux et enlevez les globes oculaires. À l’aide de DuMont #5 fine pince et ciseaux printemps faites une incision sur la face ventrale et enlever les couches superficielles de la peau pour exposer le tectum prosencéphale et optique. Peler et retirer la membrane pial soigneusement. Transférer le prosencéphale dans une autre boîte de Pétri et coupez-le en petits morceaux d’environ 2 mm avec des ciseaux de printemps.Remarque : Il faut éviter tout attachés au prosencéphale après l’ablation de la membrane pial les vaisseaux sanguins. S’il est disponible, il est préférable d’effectuer la dissection sous une hotte à dissection stériles, même si nous avons obtenu des résultats assez bonnes lorsque la dissection est effectuée en dehors d’une hotte, aussi longtemps que les instruments et la zone de dissection sont complètement stérilisés avec l’éthanol à 70 % . À l’aide d’une pipette stérile, collecter les pièces du cerveau antérieur dans un tube à centrifuger 15 mL et enlevez autant de l’HBSS que possible après avoir laissé les morceaux du prosencéphale évier au fond du tube à centrifuger. Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine/EDTA (préalablement chauffé à 37 ° C) et laisser incuber à 37 ° C pendant 15 minutes. À l’aide d’une pipette Pasteur, soigneusement retirer la trypsine sans déranger les morceaux de tissus et ajouter 1 mL de milieu de neurobasal. Laisser les morceaux de tissus évier au fond et enlever le milieu. Répéter une fois de plus ce lavage. Cette étape consiste à laver la trypsine/EDTA. Ajouter 2 mL de milieu de neurobasal et de commencer la trituration. Trituration consiste à prendre une pipette stérile de Pasteur feu poli et en passant le tissu à travers plusieurs fois doucement jusqu’à ce qu’aucuns plus de morceaux de tissus ne sont visibles. Si tous les morceaux restent après passes répétées, juste les laisser se déposer au fond.Remarque : Éviter de faire mousser tout en trituration – si la mousse forment, arrêter et supprimer par aspiration. Diluer les cellules remises en suspension 01:10 avec support neurobasal et compter les cellules viables à l’aide de colorant bleu Trypan et un hémocytomètre. Mélanger 50 µL de cellules dilués avec 50 µL de solution de bleu de Trypan dans un tube à centrifuger 0,5 mL. Ajouter 10 µL de la Hémacytomètre après avoir placé sur la lamelle couvre-objet et compter les cellules clairs brillants (cellules bleues sont morts et ne devraient pas être comptées).NOTE : Typiquement nombre de cellules d’une plage de tectum optique E7 unique compris entre 1 et 5 x 107 cellules/mL. Plaque de la dissociation des cellules sur ECM enduit ame à une densité de 2 200 cellules/carré mm. Pour notre système MEA, cela se traduit par environ 130 000 cellules par la MEA. Ajouter neurobasal moyen pour porter le volume à la MEA à 1 mL et placez les AEM dans un incubateur à CO2 pendant la nuit pour la fixation des cellules et des neurites extension (Figure 1).Remarque : Pour l’ame des différents domaines et des numéros de l’électrode, la densité des différentes cellules pouvait être jugée – en général, une densité cellulaire plus élevée se traduit par une plus grande activité du réseau, mais conduit également à des cultures vécues plus courtes. Le lendemain, ajouter BPA à une concentration finale de 10 µM dans un milieu neurobasal de la crosse de 1 mM faite à l’étape 1.1 à l’AEM traitée. Au contrôle MEA, ajouter le même volume de l’éthanol de 10 % en solution aqueuse (v/v). Moyen de remplacer passé avec neurobasal un milieu contenant 10 µM BPA tous les deux jours jusqu’à 7 jours in vitro (7DIV) et tous les jours par la suite, que l’augmentation de l’activité réseau.Remarque : Comme l’activité réseau augmente, augmente l’activité métabolique et changements de médias doivent être plus fréquentes. Ne laissez pas le milieu tourner à orange. 3. enregistrement de l’activité réseau Neuronal Le jour de l’acquisition, échanger le milieu de culture avec neurobasal frais moyen et regagner l’Ame de l’incubateur à CO2 pendant au moins 2 h avant l’enregistrement. Démarrer le logiciel d’enregistrement et de régler la température de la MEA à 37 ° C en cliquant sur l’icône de température (supplémentaire Figure 3. 1 a-b).NOTE : Enregistrement peut commencer dès que le jour 3 du bordé et peut continuer aussi longtemps que les cultures sont en vie. Définir les paramètres de l’acquisition par un clic droit sur l’icône « Muse » (selon les axes dans le panneau de gauche de la fenêtre) et choisissez « Ajouter Processing » et « Détecteur de Spike » et cliquez sur OK dans la fenêtre pop up. « Détecteur de spike (6 x STD) » apparaîtra sous le nom de fichier (supplémentaire Figure 3. 2 a-b). Ensuite, faites un clic droit sur le détecteur de Spike, sélectionnez « Ajouter la transformation » et « Détecteur de Burst » et cliquez sur OK dans la fenêtre pop up. « Détecteur de burst » (ISI) apparaîtra sous l’icône de Muse (supplémentaire Figure 3. 3 a-b). Ensuite faites un clic droit sur le détecteur de Burst, sélectionnez « Ajouter Processing » et « Neural statistiques Compiler. » Dans la fenêtre pop-up, vérifiez que le fichier en-tête, agrégées bien statistiques et Synchrony sont sélectionnés. Cliquez sur OK. « Compiler des statistiques » apparaîtra en dessous (supplémentaire Figure 3. 4 a-b).NOTE : Cette fonction définira le franchissement de seuil adaptatif (filtre de STD 6 x), l’intervalle inter-spike à 100 ms avec un nombre minimal de pointes à 5, le moyen tiré de détection du taux à 10 s avec un paramètre de synchronie à 20 ms et le taux minimal de spike à pointes 0,083333 / min. Configurer l’enregistrement programmé pour la durée d’enregistrement de 5 minutes (300 000 ms) en cliquant sur l’icône de l’horloge en bas. Ceci est réalisé en modifiant les informations contenues dans la section de configuration pour enregistrer toutes les minutes 5,1 et enregistrer pendant 5 minutes. Cela démarre immédiatement et sera exécutée une fois (Supplemental Figure 3.5). Veiller à ce que la température de la MEA a atteint 37 ° C avant de passer la MEA. Retirer l’Ame de l’incubateur, placez-le sur l’unité d’enregistrement et de verrouiller la MEA. Démarrer l’enregistrement de l’activité du réseau en cliquant sur le dossier de démarrage dans la section enregistrement programmé ou sur l’icône enregistrement dans la fenêtre « Fichier Play ». En règle générale, un temps d’enregistrement de 5 minutes (300 000 ms) est suffisant, même si des enregistrements plus longs jusqu’à 10 minutes peuvent être obtenues. Après l’enregistrement, remettez la MEA dans l’incubateur.Remarque : Veiller à maintenir la stérilité et à réduire le temps de que la MEA est en dehors de l’incubateur. 4. analyse des données Analyse des données brutes peut se faire en mode hors connexion en utilisant le logiciel d’enregistrement. Cliquez sur le menu déroulant fichier et ouvrir l’enregistrement. Sélectionnez le fichier de données brutes à analyser. Relire les enregistrements bruts pour capturer les paramètres requis de fortification. Pour obtenir le nombre moyen de pointes, utilisez le module détecteur de Spike et pour obtenir l’Index de synchronie, utiliser le module neuronal statistiques du compilateur. Charger le Spike détecteur, détecteur de rafale et de statistiques du compilateur Modules comme avant (Section 3). Dans les menus déroulants dans le détecteur de Spike, détecteur de Burst et statistiques du compilateur module windows, sélectionnez liste de Spike, réseau Burst liste et Advanced Metrics, respectivement. Cliquez sur le bouton d’enregistrement pour commencer à enregistrer le fichier de données qui permettra de créer un fichier .csv dans le dossier réalisé. Les paramètres de spike – le nombre total de clous ou de l’Index de synchronie – seront enregistrées dans le fichier .csv.Remarque : analyse en temps réel lors de l’enregistrement des données brutes est déconseillé car cela pourrait consommer de temps processeur et ressources informatiques.