التعرض للسموم البيئية يمكن أن تؤثر بشدة الأجنة النامية. الصماء المواد الكيميائية مثل بيسفينولس معروفة تؤثر تأثيراً سلبيا على الجهاز العصبي. هنا يمكننا وصف بروتوكول باستخدام نموذج شبكة العصبية فقاريات (الجنين الفرخ) في المختبر لدراسة تأثير الوظيفية للتعرض للسمية على الأجنة في وقت مبكر.
مكررا-الفينول، مثل الفينول مكررا أ (BPA) ومكررا-الفينول-S (BPS)، هي مبلمرة وكلاء المستخدمة على نطاق واسع في إنتاج البلاستيك والمنتجات اليومية العديدة. أنها تصنف كمركبات تحريف الغدد الصماء (EDC) مع خصائص مثل استراديول. وقد ربط التعرض الطويل الأمد ليشكل، حتى في الجرعات المنخفضة، مع مختلف العيوب الصحية بما في ذلك السرطان، والاضطرابات السلوكية، والعقم، ومع مزيد من الضعف خلال فترات النمو المبكر. لدراسة آثار BPA على تطوير وظيفة الخلايا العصبية، استخدمنا في المختبر العصبية شبكة المستمدة من الدماغ الفرخ الجنينية المبكرة كنموذج. لقد وجدنا أن التعرض لمنهاج عمل بيجين أثرت تطوير نشاط الشبكة، على وجه التحديد النتوءات النشاط والمزامنة. تغيير في نشاط الشبكة من صلة أساسية بين الهدف الجزيئية لدواء أو مركب وأثره على النتائج السلوكية. صفائف متعدد القطب بشكل متزايد أدوات مفيدة لدراسة آثار المخدرات على نشاط الشبكة في المختبر. هناك العديد من النظم المتاحة في السوق، وعلى الرغم من أن هناك اختلافات في عدد الأقطاب ونوع ونوعية الصفيف القطب والبرمجيات التحليل، والمبادئ الأساسية، والحصول على البيانات هو نفسه عبر أنظمة مختلفة. رغم حاليا يقتصر على تحليل للثقافات ثنائي الأبعاد في المختبر ، ويجري تحسين هذه النظم اتفاق بيئي متعدد الأطراف لتمكين في فيفو نشاط الشبكة في شرائح المخ. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتعرض الجنينية وتسجيل نشاط شبكة الخلايا العصبية والتزامن، جنبا إلى جنب مع نتائج تمثيلية.
4، 4-إيسوبروبيليدينيديفينول، يشار إليها عادة Bisphenol A أو منهاج عمل بيجين، كمادة مضافة مضادة لأكسدة وجدت في مجموعة متنوعة واسعة من البولي والايبوكسي الراتنج على أساس المنتجات بدءاً من ورق حراري، الأقراص المدمجة، وتحطيم الزجاج، إلى الداخل دليلاً على طلاء من علب المشروبات. على الرغم من أن منهاج عمل بيجين كان من المعروف أن تكون عامل تحريف الغدد الصماء الذي يحاكي الإستروجين1، دراسات عن آثارها السيئة بسبب التعرض العرضي اليومية لمنهاج عمل بيجين معظمهم تخرج في السنوات 10-15 الماضية. النتائج المترتبة على انخفاض حتى مستويات التعرض BPA الأكثر عمقاً في أوائل فترات الإنمائية، بما في ذلك من خلال امبريوجينيسيس من خلال التعرض للأمهات2،3. كما ارتبط بقابلية المرض زيادة في الرحم التعرض للأجنة الإناث للمواد الكيميائية الصماء من المهبل لسرطان الثدي4،5. وقد أثبتت الدراسات الحيوانية يؤدي التعرض لمنهاج عمل بيجين إلى بنية الدماغ شاذة وتشوهات وظيفية تتجلى في السلوك6. نتيجة لذلك، حظرت استخدام منهاج عمل بيجين في زجاجات إرضاع الرضع الوكالات التنظيمية الأكثر في أوروبا وأمريكا الشمالية، بما في ذلك إدارة الأغذية والعقاقير. الامتثال للوائح، تحولت العديد من الشركات المصنعة إلى 4، 4 ‘–سولفونيلديفينول أو bisphenol-S (BPS). استناداً إلى حقيقة أن منهاج عمل بيجين و BPS بنظائرها الهيكلية وأن التقارير الأخيرة أظهرت فاعلية قابلة للمقارنة من BPS في النسخ إستروجين7، من المهم دراسة السمية لهذا المركب بالنسبة لمنهاج عمل بيجين.
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لاختبار آثار منهاج عمل بيجين (وأخرى يشكل) على شبكات الخلايا العصبية باستخدام نموذج الفقارية، الجنين الفرخ. تشكل الاتصالات متشابك في المختبر الثقافات من الخلايا العصبية وتوليد إمكانات العمل (تسمى أيضا المسامير). يمكن تسجيل النشاط التشويك من هذه الثقافات باستخدام أنظمة الصفيف متعدد القطب (طيران الشرق الأوسط). تعتبر المسامير تكون في التزامن عند حدوثها داخل 5 مللي ثانية من بعضها البعض. نشاط التشويك عشوائية أولية في نهاية المطاف بالتزامن سمة رئيسية لتطوير الشبكات العصبية8،9. عدة خوارزميات يرد في الأدب9،،من1011والتزامن يمكن أن تقاس باستخدام أساليب مختلفة. في تحليلاتنا، نستخدم خوارزمية وضعتها إيفا وزملاء العمل12 التي يتم إدماجها في برنامج التسجيل الذي يدفع نظام الاستحواذ على شركة طيران الشرق الأوسط. نشاط الخلايا العصبية الجنينية الفرخ التشويك قوي يوفر نموذجا لدراسة تأثير منهاج عمل بيجين على نشاط شبكات عصبونية13. استخدام صفائف متعدد القطب إلى سجل النشاط التشويك، لاحظنا أن التعرض BPA يحول دون تنمية الخلايا العصبية التشويك تتسق9،14. هنا، نحن نقدم منهجية مفصلة لدراسة التعرض BPA على الفرخ الجنين العصبية في الثقافة جنبا إلى جنب مع نتائج الممثل على وضع التزامن التشويك الخلايا العصبية في ثقافات بدائية الفرخ.
مراحل النمو السريع والتنمية مثل embryogenesis معرضة بشكل خاص للآثار الضارة للمركبات الصماء المختلفة، بما في ذلك منهاج عمل بيجين. نحن توفير بروتوكولات مفصلة لدراسة آثار التعرض BPA في نموذج شبكة العصبية فقاريات في المختبر . باستخدام هذا البروتوكول، أنشأنا أن منهاج عمل بيجين يخفض معدل سبايك فضلا عن فهرس تتسق في الشبكات العصبية النامية (الشكل 2أ-ب).
كانت تهدف إلى دراسة التعرض BPA أثناء embryogenesis المبكر منهجيتنا ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة آثار أخرى يشكل. الثقافات الخلايا العصبية الجنينية من الفرخ سهلة نسبيا لإقامة مقارنة بالنماذج الفقاريات الأخرى، بما في ذلك الفئران أو الماوس. وعلاوة على ذلك، ليس هناك اشتراط لغرفة منفصلة لحيوان – حاضنة بسيطة على مقاعد البدلاء مختبر غير كافية لإجراء هذه الاختبارات. يصف لنا استخدام نظام متعدد القطب (طيران الشرق الأوسط) لتقييم تأثير تنمية الصادرات، منهاج عمل بيجين، على نشاط الشبكة. يمكن تطبيق البروتوكولات المذكورة هنا إلى أنظمة أخرى. جانبا مهما من هذا البروتوكول هو الحفاظ على العقم. وهذا يشمل تشريح الجنين تحت ظروف معقمة – تعقيم الصكوك مع الإيثانول 70% واستخدام “الحل” العقيمة هانك المتوازن أملاح غير كافية. كما يتم جمع البيانات على مدى فترة من أسابيع، من المهم الحفاظ على مناولة العقيمة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. الثقافات العصبية متى أنشئت يمكن تكون مثقف طويل الأجل-تصل إلى ثلاثة أشهر، وبالتالي فهي مفيدة لدراسة التعرض الطويل الأمد ليشكل والمركبات الأخرى في الشبكات العصبية. جانب آخر مهم من هذا البروتوكول هو الوقت من تشريح للطلاء. الوقت الأمثل 30 دقيقة، بما في ذلك الحضانة للأنسجة مع التربسين. يعد الوقت الذي يستغرقه، أكثر فقراً وبقاء الخلايا.
ونحن هنا وصف بروتوكول أساسية التي يمكن تطبيقها لتقييم أي مادة كيميائية أو المخدرات التي تؤثر على السلوك والوظيفة العصبية. هنا، لدينا تستخدم بكثافة خلية من الخلايا 2,200 الواحد مم2؛ ومع ذلك، يمكن تعديل هذه وكثافات خلية أخرى يمكن استخدامها. وبصفة عامة، فقد وجدنا أن زيادة كثافة الخلية يزيد نشاط الشبكة–أكثر من طفرات في وقت أقصر. وصف الأسلوب، رغم أن ذلك مفيد جداً في تقييم آثار المواد الكيميائية على نشاط الشبكة تعاني من أوجه قصور. واحدة من أعظم أوجه القصور في الأسلوب أن هذه الثقافات في المختبر اثنين الأبعاد قد لا تعكس بنية ثلاثية الأبعاد للدماغ الفقاريات. ويمكن التغلب على هذا باستخدام تسجيلات شريحة. بديل آخر تطبيق العلاجات على الجنين النامي الفرخ يعني من نافذة صغيرة قطع في نهاية واسعة من البيض15، تشريح الدماغ في نهاية نظام المعالجة، وجعل أبواب سميكة على فيبرتوم، ووضع على شركة طيران الشرق الأوسط تسجيل نشاط الشبكة.
لدينا بروتوكول مهم حيث أنه يمكن دراسة أثر يشكل على تطوير نشاط الشبكة ويوفر استكشاف أساس الميكانيكية لآثار هذه المواد الكيميائية.
The authors have nothing to disclose.
هذه الدراسة معتمد من قبل جبهة الخلاص الوطني (هبكو إلى أعلى جائزة بدء البحث، 1401426 تنمية الموارد البشرية و EPS ابسكور-0814251)، والمعاهد الوطنية للصحة (نحاس 1P20GM103653-01A1). ك. س. معتمد من قبل على زمالة من 6404 الثالث إينبري في ولاية ديلاوير.
#5 foreceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Axion Muse MEA | Axion Biosystems | M64-GL1-30Pt200 | Will be called MEA system in manuscript |
Axis Software | Axion Biosystems | Will be called recording software in the manuscript | |
BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
curved forceps | Fine Science Tools | 11272-50 | |
EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
Fertilized chicken eggs | from any local farm or Spafas | ||
HBSS | Fisher | 14170112 | |
Hemacytometer | Fisher | 02-671-6 | |
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356231 | Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript |
Neurobasal medium | BrainBits | Nb4-500 | |
Neuroexplorer statistical software | Nex Technologies | Neuroexplorer version 5 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20A | |
spring scissors | Fine Science Tools | 15514-12 | |
Sylgard bottom dissection dishes | Living Systems Instrumentaion | DD-90-S-BLK-3PK | |
Trypan Blue dye | Fisher | 15-250-061 | |
Trypsin-EDTA | Fisher | 15400054 |