Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging
Özet
Amyloid-Ablagerungen ist ein Markenzeichen von verschiedenen Krankheiten und viele andere Organe befällt. Dieses Papier beschreibt die Anwendung der leuchtenden konjugierte Oligothiophene Fluoreszenz Färbung in Kombination mit Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken. Diese Färbung Methode darstellt, ein leistungsstarkes Tool für die Erkennung und Erforschung von Proteinaggregaten in klinischen und wissenschaftlichen Einrichtungen.
Abstract
Proteine, die als Amyloid im Gewebe im gesamten Körper ablagern können die Ursache oder die Folge einer großen Anzahl von Krankheiten sein. Unter diesen finden wir neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson leidet vor allem das zentrale Nervensystem und systemische Amyloidose wo einzahlen Serum Amyloid A, Transthyretin und IgG Lichterketten als Amyloid in Leber, Karpaltunnelsyndrom Tunnel, Milz, Nieren, Herz und anderen peripheren Geweben. Amyloid ist bekannt und seit mehr als einem Jahrhundert oft mit Amyloid bestimmte Farbstoffe wie Kongo-rot und Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin (ThS) untersucht. In diesem Beitrag präsentieren wir Heptamer-Formyl Thiophen Essigsäure (hFTAA) als Beispiel für neu entwickelte Ergänzungen zu dieser Farbstoffe lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes (LCOs) genannt. hFTAA ist einfach zu bedienen und ist kompatibel mit Co Färbung in Immunfluoreszenz oder anderen zellulären Marker. Umfangreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass hFTAA ein breiteres Spektrum von Proteinaggregaten Krankheit verbunden sind als herkömmliche Amyloid Farbstoffe entdeckt. Darüber hinaus kann hFTAA auch für optische Zuordnung der unterschiedlichen aggregierten Morphotypen Studien von Amyloid Fibrille Polymorphismus ermöglichen angewendet werden. Die bildgebende angewandte Methodik ist, zwar optional wir hier zeigen hyperspektralen Bildgebung (KIS), laser-Scan konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz-Lebensdauer-imaging (FLIM). Diese Beispiele zeigen einige der bildgebenden Techniken wo können LCOs als Werkzeuge verwendet werden, um mehr Detailkenntnisse über die Bildung und strukturellen Eigenschaften von Amyloiden zu gewinnen. Eine wichtige Einschränkung, die Technik ist wie bei allen konventionellen Lichtmikroskopie-Techniken, die Forderung nach mikroskopischer Größe der Aggregate um Erkennung zu ermöglichen. Weiterhin sollte das Aggregat umfassen eine sich wiederholende Struktur wie β-Sheet hFTAA Bindung zu ermöglichen. Übermäßige Fixierung und/oder Epitop Exposition, die die aggregierten Struktur oder Konformation ändern kann schlechte hFTAA verbindlich zu machen und daher Beschränkungen in Bezug auf genaue Bildgebung darstellen.
Introduction
Ablagerung von Amyloid in Geweben ist eine pathologische Markenzeichen in einer Anzahl Krankheiten wie Alzheimer, Morbus Parkinson, systemische Amyloidose und Prion-Krankheiten. Trotz der Prävalenz von Amyloid-Erkrankungen und die Tatsache, die in der Nähe von 40 verschiedenen Proteinen bis dato als Amyloid Vorläufer in menschlichen1klassifiziert wurden, ist wenig über das Verhältnis von Amyloid-Ablagerungen und Krankheit Phänotyp bekannt. Histologie der Proben von menschlichen Patienten wurde sowohl für diagnostische und wissenschaftliche Zwecke verwendet. Eine große Anzahl von Tiermodellen eingerichtet, um die Korrelation zwischen Amyloid Belastung und Verhalten, Lebensdauer und etliche andere phänotypische lesen untersuchen Outs der Krankheit Fortschreiten2,3. In der Arzneimittelforschung und Design zu unseren am meisten gefürchteten Volkskrankheiten Kampf werden auch große Anstrengungen unternommen. Allerdings ist die Bewertung des Zusammenhangs zwischen Genotyp, Phänotyp, Amyloid-Plaques Belastung und Medikamentengabe nicht geradlinig. Die Werkzeuge zum Beizen und imaging von Amyloid in Geweben sind oft stumpf und niedriger Auflösung informieren über Amyloid Entstehung und Struktur.
Kongo-rot Doppelbrechung, ThT und ThS Fluoreszenz sind Beispiele für klassische Methoden zur Erkennung und Analyse von Amyloid Belastung in Gewebeproben von Patienten Biopsien und Post-Mortem-Proben und Tiermodellen der Krankheit4. Diese Techniken werden seit mehreren Jahrzehnten (Kongo-rot seit den 1920er Jahren und ThT und Derivate seit den 1960er Jahren), und obwohl Instrumentierung verfeinert wurde und eine detaillierte Analyse ermöglicht, die befleckenden Verfahren und Analysen werden noch durchgeführt auf die gleiche Weise wie vor fast einem Jahrhundert.
In diesem Artikel beschreiben wir die Nutzung eines hochsensiblen Roman Amyloid Farbstoffes, hFTAA5, die die Erkennung von kleinen unreifen Proteinablagerungen mit hoher Genauigkeit sowie die Erkennung von Reifen Amyloid ermöglicht. Im Vergleich zu konventionellen Farbstoffen, hFTAA nachweislich um ein breiteres Spektrum von Krankheit erkennen Protein Aggregate5,6,7verbunden. Darüber hinaus kann hFTAA auch für optische Zuordnung der unterschiedlichen aggregierten Morphotypen8angewendet werden. Hier beschreiben wir hFTAA Färbung und Analyse des Gewebes von etablierten Tiermodellen der Prion-Krankheit und Amyloid-β Precursor-Protein (APP) transgene Mäuse entwickelt, um Plaque-Entwicklung in der Alzheimer-Krankheit9,10 imitieren . Wir zeigen auch Analyse von Diagnose- und Post-Mortem-Proben von Patienten mit systemischer Amyloidose. Die LCOs haben intrinsische Eigenschaften, die ihnen ermöglicht, über Konformationsänderungen Unterschiede innerhalb einer Plakette zu berichten; und durch die Kombination von zwei LCOs mit unterschiedlichen Eigenschaften hinsichtlich Bindung und Fluoreszenz, der Unterschied noch deutlicher ist11. Einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit langen Pass Filter ausgestattet und ein hyperspektrale Kamerakopf wird verwendet, um objektive Klassifizierung der spektralen Eigenschaften und Aufzeichnung der Aufnahmen für die Spektral-Analyse zu ermöglichen. Konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit einem abstimmbaren Laser als die Anregungsquelle wird verwendet, um die dreidimensionale Eigenschaften eines Amyloid-Plaques im Detail zu bewerten. Durchstimmbare Laser ermöglicht Sammlung von Anregungsspektrums und eine stufenlose Auswahl von Emission Wellenlängen auf dem Mikroskop ermöglicht Co Bildgebung LCO Fluoreszenz und Immunfluoreszenz Co Lokalisierung von Zielprotein und Amyloid zu bestimmen. FLIM bietet beispiellose Empfindlichkeit gegenüber Konformationsänderungen Unterschiede der LCOs auferlegt und zeigen sich Unterschiede, die nicht auf der Fluoreszenz-Emissionsspektren erkannt werden könnte.
Die wichtigsten Ziele mit dem beschriebenen befleckenden Verfahren sind empfindliche Detektion von kleinen Amyloid-Ablagerungen zu erleichtern und Konformationsänderungen Polymorphismus innerhalb von Amyloid-Ablagerungen zu charakterisieren. Dieses Wissen ist wichtig für das grundlegende Verständnis von Protein Aggregation Krankheiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ablagerung von akzessorisch gefaltete Proteine in Amyloid ist ein zentrales Ereignis der vielen Krankheitsprozessen. Extrazelluläre Amyloid-Plaques aus Aβ-Peptide und intrazelluläre neurofibrillären Verschlingungen durch hyperphosphoryliertem Tau gebildet werden im Gehirn von Alzheimer-Patienten gefunden. Eine Auswahl der verschiedenen Proteinen, z.B., Transthyretin (TTR), Komponente Serum Amyloid A (SAA) und IgG Lichterkette Misfold und manifestiert sich als Amyloid-Ablagerungen im Gewebe außerhalb des ZNS. Obwohl Amyloid Ablagerungen wurden bekannt und studierte seit mehr als einem Jahrhundert, wir noch fehlen detaillierte Kenntnis der wie Amyloid wird Ablagerung auf molekularer Ebene und was kann getan werden, um zu verhindern, dass dieser Prozess initiiert. Für die Alzheimer-Krankheit ist es notwendig zu bestätigen, wie der Prozess der Amyloidose Neurodegeneration zugeordnet ist. Ein Schlüssel-Quest auf der Mission, Amyloidose zu behandeln ist, Entwicklung neuer Tools für die Überwachung von Amyloid Einleitung, Progression und Regression verfeinert; Daher ist die gezielte Amyloid Erkennung Schlüssel. Auf lange Sicht profitieren klinische Diagnostik erhöht die Empfindlichkeit und Selektivität von Amyloid Färbung Methoden7,15. Aktuelle Herausforderungen in dieser Hinsicht sind enorm und ist ein sehr aktives Forschungsgebiet. Ein Hauptproblem für die klinische Entwicklung und Studien ist prognostische Diagnose. Diese Krankheiten wahrscheinlich beginnen, lange bevor Symptome auftreten, aber mit zu beginnen Behandlung Identifizierung der Krankheit muss. Empfindlichkeit ist hier ein wichtiger Aspekt für neuartige Methoden. Darüber hinaus ist dieses Problem noch komplizierter, weil einige Protein-Aggregate giftig sind, einige sind Schutz- und einige sind neutral. Daher unbedingt die Möglichkeit, bestimmte aggregierte Morphotypen überwachen, da die Existenz von aggregierten Arten vorgeschlagen worden ist, um zu erklären, die heterogene Phänotyp für eine Vielfalt von neurodegenerativen Protein Aggregation Erkrankungen gemeldet. Zum Beispiel ist das Prion-Protein ein klassisches Beispiel dafür, wie eine identische primäre Sequenz der Aminosäuren in unterschiedliche Aggregat Morphotypen, misfold kann die spezifische Prion Belastungen hervorrufen. Ähnliche Polymorphismus wurde auch für die Aβ-Peptid, α-Synuclein und Tau berichtet. In diesem Zusammenhang wurden LCOs gezeigt, hervorragende Werkzeuge für optische Zuordnung der unterschiedlichen aggregierten Morphotypen sein. Prion-Stamm-spezifische Protein aggregiert, Proteinablagerungen in mehrere Arten von systemischen Amyloidose sowie polymorphe Aβ gefunden und Tau Aggregate durch die conformationally induzierte optische Erscheinung, beobachtet von der LCOs ausgezeichnet.
Amyloid-Ablagerung ist ein Ereignis, das im Gewebe, die schwer stattfindet zu durchdringen mit biochemischen und biophysikalischen Methoden der molekularen Präzision. Die Möglichkeit, Ereignisse ex Vivo, in Vivound in Vitro die gleichen LCO-Moleküle mit Sonde Bühnenbilder die für entwirren Ereignisse in Vivo mit Techniken, die nur möglich auf ex Vivo oder anzuwenden sind Vitro 11,17Proben. Ein kürzlich berichtet hochauflösende strukturelle Modell zeigt, dass die LCO Pentameric FTAA (pFTAA) in einem Hohlraum gebildet durch abgestimmte Seitenketten parallel zur Fibrille Achse umfasst 6 parallele Beta-Stränge in Register18 bindet, zeigt, dass es möglich, atomarer Auflösung wissen über die Elemente des Ziels LCO gewinnen. Im wesentlichen ähnelt der Bindungsmodus Hohlraum und Bindung des pFTAA der Kongo-rot19, diktiert durch eine Nut mit sich wiederholenden positiv geladenen Lys-Seitenketten ausgekleidet. Die Affinität der LCOs scheinen besser zu Kongo-rot wahrscheinlich wegen Kette Flexibilität und starke van der Waals Wechselwirkungen der Atome Schwefel der Thiophen Ringe gegenüber dem hydrophoben Hohlraum verglichen werden. Die Erkennung von prefibrillar Arten (vor ThT antwortet)5,20 erscheint abhängig von sich wiederholenden β Blätter, bestehend aus-Register Parallel-Beta-Stränge, die für hFTAA werden zwei Thiophen Einheiten länger als pFTAA wäre umfassen Sie Kreuzung von bis zu 8 Beta-Stränge.
Die Färbung Protokoll erfordert Aufmerksamkeit auf die folgenden Schritte zur Fehlerbehebung: (i) Fixierung: umfangreiche Fixierung von Gewebeproben stören die Amyloide-Struktur und begrenzen die Möglichkeit, in Fluoreszenz Spektren durch induzierte Variation erkennen kann Konformationsänderungen Verzerrung des Moleküls hFTAA. Milde Fixierung des Cryosections aus Tiefkühlfrische Material wird bevorzugt, um optimale spektrale Auflösung zu erreichen. Jedoch wird hFTAA beflecken und fluoreszieren Amyloid im festen Gewebe jedoch mit verminderten Wirksamkeit und weniger spektrale Variation. (Ii) Epitop Exposition: Vorbehandlung des Gewebes zu Epitop Belichtung zu erzielen, für die Antikörperbindung gelegentlich die Möglichkeit für hFTAA wegen der Bindung reduzieren könnte gestört Amyloid Struktur. Wenn dies ein Problem, und Epitop Exposition ein entscheidender Schritt in der Antikörper Färbeprotokoll ist, mit aufeinanderfolgenden Abschnitten für Antikörper und hFTAA, kann bzw. betrachtet werden. (Iii) overstaining: hFTAA ist extrem empfindlich. Funktionierende Lösungen sollten bei niedrigen nM Konzentration gehalten werden. Verringern Sie die Konzentration der hFTAA Hintergrundfärbung ist ein Problem. Wenn Elemente, die hFTAA binden spärlich im Gewebe sind, kann ein Übermaß an hFTAA aggregieren und reichern sich in der Montage-Medium. Dies wird als Fluoreszenz anerkannt, die nicht in der Fokusebene des Gewebes selbst. Wenn dies angezeigt wird, Tauchen Sie die angebrachte Folie mit PBS-Puffer bis das Deckglas des Abschnitts verschiebbar, waschen mit PBS und remount mit frischen Eindeckmittel und einem neuen Deckglas. (iv) Filter basierte Bildgebung: dieses Paper beschreibt meist spektral aufgelöst Fluoreszenz-Bildgebung mit langen Pass filtern oder mehrere Erkennung Kanäle. hFTAA kann auch mit kurzen Pass Filter überwacht werden. Bitte beachten Sie, dass dadurch verringert sich den Kontrast und Abschaffung der Möglichkeiten um mehrere Farben zu erkennen.
In den vergangenen Jahren hat gezeigt, dass als Werkzeuge, fluoreszierende LCOs Forschung und insbesondere hFTAA zeigen vielversprechende Eigenschaften. Ergebnisse haben gezeigt, für eine Vielzahl von Proteinen und Krankheitszustände, angefangen bei hFTAA Erkennung der Aggregate innerhalb der Zellen (Tau, Einbeziehung Körper Myositis), systemische Amyloid Serum Amyloid A, Transthyretin, Immunglobulin-Leichtketten (Kappa und Lambda) Seminogelin 1, Prion-Protein (einschließlich klinische Proben)21Islet Amyloid Polypeptid und Insulin7,15. Ein limitierender Faktor für die Umsetzung der hFTAA als diagnostisches Werkzeug ist, dass die Fluoreszenz-Mikroskopie nicht ausgiebig in Routine Amyloid Pathologie Labors verwendet wird. Darüber hinaus ist er in der Klinik nicht erhältlich. Allerdings hFTAA Amyloid Färbung und Fluoreszenz-Mikroskopie in klinischen Labors in einem Filter basierend Fluoreszenzmikroskop benutzt worden und sollteals ein kostenloses diagnostisches Verfahren betrachtet werden. Dies zeigte sich vor kurzem auf Karpaltunnel Biopsien mit Transthyretin-Amyloidose mit Grundeinstellungen für Fluoreszenz in einer automatisierten Weise22.
Darüber hinaus neben verschiedenen Proteinen hFTAA Fluoreszenz erkennt eine Vielzahl von Fibrille Typen und Pre fibrillären Amyloid Aggregate, z.B., Weg fibrillären Arten erkannt und gekennzeichnet wurden. In dieser Publikation haben wir eine LCO auf verschiedenen Probenarten mit drei Mikroskopiertechniken demonstriert. Die Verwendung von kontrollierten Synthese hat auch für die Entwicklung von LCOs für vielseitige Erkennung von biomolekularen Ziele, z.B.Erfassung von Interaktionen durch Surface Plasmon Resonance (SPR)23 und enzymatische für Positronen Emissions erlaubt. Tomographie (PET)24.
Bis heute wurden mehr als 25 verschiedenen LCOs mit veröffentlicht. Ein vermehrter Einsatz von LCOs für die Darstellung von Amyloidablagerungen erhöht sich das Wissen und Verständnis, wie diese Krankheit verbundenen Aggregate montieren, demontieren und stören die Organe und Personen, die in denen sie wohnen.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Mikael Lindgren und Chanan Sluzny Danke für Ratschläge, Fluoreszenz-Mikroskopie und Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark pro Westermark und Kurt Zatloukal zur Verfügung gestellt Gewebeschnitte oder Aufnahmen, die in dieser Publikation angezeigt. Die Auflistung der hier präsentierten Daten durch Beiträge von schwedischen Brain Foundation (Hjärnfonden), der schwedischen Alzheimer Association (Alzheimerfonden), der schwedischen Forschungsrat (VR), der Verein Göran Gustafsson Georg finanziert wurde & Astrid Olsson, EU FP7 Gesundheitsprojekt LUPAS und Universität Linköping.
Materials
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
Referanslar
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