Degeneración secundaria de las células ganglionares de la retina (RGCs) ocurre comúnmente en glaucoma. Este estudio describe un enfoque innovador de la operativo de transección parcial del nervio óptico. El uso de este acercamiento operativo de ahorro de espacio amplía la gama de aplicación y permite la exploración de los mecanismos de lesión secundaria en RGCs en una nueva forma.
Estudios anteriores han demostrado que la degeneración secundaria de las células ganglionares de la retina (RGCs) ocurre comúnmente en glaucoma. Transección parcial del nervio óptico es considerada como un modelo útil y reproducible. En comparación con otros modelos de lesión del nervio óptico utilizados comúnmente para evaluar la degeneración secundaria, e.g. transection del completa del nervio óptico y del nervio óptico crush modelos, el modelo de transección parcial del nervio óptico es superior que distingue primaria de la degeneración secundaria en situ. Por lo tanto, sirve como una excelente herramienta para evaluar la degeneración secundaria. Este estudio describe un nuevo enfoque operativo de transección parcial del nervio óptico accediendo directamente a la zona del nervio óptico retrobulbar a través de la pared orbital lateral del globo ocular. Además, presentamos un nuevo diseño, bajo costo instrumento quirúrgico para ayudar con el transection. Como lo demuestran los resultados representativos en la distinción de los límites de las áreas de lesión primaria y secundaria, el nuevo enfoque y el instrumento asegura alta eficiencia y estabilidad del modelo proporcionando un espacio adecuado para la intervención quirúrgica. Esto a su vez hace fácil separar los vasos oftálmicos y envoltura meníngea del nervio óptico antes de corte transversal. Un beneficio adicional es que este enfoque de ahorro de espacio operativo mejora la capacidad de los investigadores para administrar drogas, portadores o trazadores RGC selectivo sobre el muñón del nervio óptico seccionado parcialmente, permitiendo la exploración de los mecanismos detrás de lesión secundaria en RGCs, de una manera nueva.
Degeneración secundaria ocurre comúnmente en el sistema nervioso central (SNC) después de lesiones traumáticas y enfermedades neurodegenerativas agudas y crónicas siguientes. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 la muerte de neuronas y células gliales como consecuencia temprana de eventos patológicos primarios se denomina degeneración primaria, mientras que la degeneración secundaria se refiere a la muerte de neuronas y células gliales, que no son o sólo parcialmente afectadas por primaria daño. Degeneración secundaria de RGCs también se cree para ocurrir en glaucoma. 6 yolas et al. 7 confirmó que la lesión secundaria de RGCs ocurre en el modelo de lesión del nervio óptico. Demostraron que las neuronas cuyos axones no resultaron heridas después de un daño agudo degenerará finalmente debido al ambiente degenerativo producción por la lesión que rodea los axones. Esta degeneración secundaria afecta a las neuronas de manera progresiva, relacionado con la gravedad de los daños infligidos. Hasta ahora, los mecanismos subyacentes de daño leve en el glaucoma no quedan claros, especialmente los relacionados con la lesión secundaria, que se traduce en insuficiente tratamiento clínico. 8 , 9 , 10 por tanto, es necesario explorar los mecanismos subyacentes de la degeneración secundaria de RGCs durante el desarrollo del glaucoma. 11 establecimiento de modelos animales de lesión secundaria que cuantitativamente puede determinar el tamaño, la distribución y el mecanismo de degeneración secundaria del RGCs atrae cada vez más atención de los científicos que estudian el daño secundario de RGCs.
Para aclarar esta cuestión, un modelo de rata PONT fue establecido por Verbin Levkovitch et al. 12 para evaluar lesión axonal inducida por la degeneración y muerte de RGCs. Este modelo se cree que constituyen una buena herramienta para explorar los mecanismos de degeneración secundaria e identificar a los posibles agentes neuroprotectores. El instrumento utilizado para generar este modelo de la lesión secundaria es un cuchillo de diamante con una escala de transecto cuantitativamente mediante el establecimiento de la profundidad de la abscisión a través de la perilla del dial, con el fin de completar una cuantitativa transección del nervio óptico. Se acerca a la vía quirúrgica de la conjuntiva del globo ocular hacia arriba o temporal. Durante el proceso quirúrgico, la retina y nervios ópticos puede verse afectados por la fuerza de la pinza, que a su vez puede causar lesión primaria. Más importante aún, debido al espacio limitado del nervio óptico expuesto, es difícil separar la envoltura meníngea antes de incisión. Por lo tanto, es posible dañar los vasos oftálmicos durante la transección parcial del nervio óptico, que resulta en isquemia retiniana y el fracaso del modelo. Además, el cuchillo del diamante es costoso, y cada uso disminuye la agudeza de la punta. Esto a su vez puede afectar la profundidad y el efecto de modelado.
El modelo de la degeneración secundaria de RGCs descrito en este estudio se obtuvo a través de un nuevo enfoque quirúrgico de la pared orbital lateral del globo ocular. Este nuevo enfoque operativo accede directamente al nervio óptico retrobulbar por el cono del músculo orbital, evitando la lesión primaria del globo ocular y el nervio óptico al tirar hacia abajo o hacia el lado lateral nasal del globo ocular. Esto también aumenta el espacio de intervención quirúrgica durante el establecimiento del modelo y permite el aislamiento de la envoltura meníngea antes parcialmente transecting el nervio óptico. Es importante hacer notar que la participación accidental y lesiones de los vasos oftálmicos pueden conducir al fracaso del modelo. Además, el modelo permite una evaluación de seguimiento de las células transfected, medicamentos y reactivos en el muñón del nervio óptico seccionado parcialmente. El instrumento quirúrgico diseñado es barato y puede ser usado varias veces, reduciendo así el coste del modelo. El modelo de lesión secundaria de RGCs establecido por este método fue demostrado para tener estabilidad y buena reproducibilidad.
Procedimiento operacional
Existen algunos puntos dignos de nota en el proceso de construcción del modelo. En el paso 4.2, el movimiento quirúrgico debe realizarse con cuidado para evitar dañar la vasculatura por encima del músculo subfascial. Especialmente, cuando se corta la fascia subcutánea en el canto lateral externo, fórceps dentado agudo deben usarse para tirar hacia arriba de la fascia subcutánea sobre la superficie de la fascia verticalmente; la fascia debe cortarse con Vannas primavera tijeras para evitar daño a la vena orbital en el ángulo del ojo externo, que puede resultar en el fracaso del modelo por sangrado excesivo. Paso 4.3 tiene la ventaja de prevenir potencialmente el sangrado al retirar directamente de los vasos sanguíneos. En la separación de los músculos orbitales en paso 4.5, la razón de selección sharp-serrada fórceps pero no Vannas tijeras del resorte es para evitar el sangrado y la hemorragia continua. Los músculos se separan claramente en ambos lados en la dirección perpendicular a la incisión de la fascia de la piel; mientras tanto, los músculos profundos de la órbita se estiran hacia fuera y periféricamente. Este procedimiento revela porciones más profundas de la cavidad orbital, proporcionando una ventana quirúrgica y permitir el acceso sin trabas a los tejidos del nervio óptico de sobreposición. En el procedimiento anterior, si se presenta sangrado, debe aplicar presión utilizando estéril quirúrgica o bastoncillos de algodón. Sangrado menor se detendrá después de varios segundos por este procedimiento. El propósito del paso 4.6 es facilitar las operaciones de seguimiento para quitar fácilmente algunos músculos grasa y separados en el cono muscular de órbita para exponer el nervio óptico a lo largo de la dirección del nervio óptico en la profundidad orbital.
Las partes más importantes del protocolo actual son pasos 5.1-5.6. Es importante no dañar la vasculatura alrededor de la cabeza del nervio óptico. El nervio óptico debe ser parcialmente transversalmente por lo menos 1.5-2.0 mm de la parte posterior del ojo, para evitar cualquier daño a la arteria oftálmica que penetra el nervio dentro de 1 mm del ojo y suministra sangre a la retina interna. El propósito de cortar el músculo recto lateral es lograr la mejor exposición del nervio óptico como el músculo recto lateral es amplia y obviamente bloquea la vista del nervio óptico. Mientras tanto, para evitar la eliminación de la arteria oftálmica que se asocia con la envoltura meníngea (figura 5), es necesario separar, disociar el dura alrededor del nervio óptico y examinar el patrón vascular de la envoltura meníngea, con unas pinzas para girar suavemente la vaina. Además, debe identificarse un área desprovista de vasos sanguíneos, permitiendo un corte longitudinal en la vaina meníngea. También es necesario mantener una pequeña distancia de trabajo de la parte posterior del ojo, para evitar la porción de la duramadre que está estrechamente relacionada con la arteria oftálmica. La retina es normalmente transparente, y los vasos sanguíneos puede ser claramente demarcados. En caso de suministro de sangre retiniana dañada, la retina es degenerada, conduce a una apariencia floculenta blanco lechoso. La cámara vítrea del ojo y la lente normalmente será nublada, con un tamaño de ojo disminución con el tiempo. En este estudio, imágenes preoperatorias y postoperatorias del fondo no confirman dañar el suministro de sangre de fondo en el modelo después de aplicar los pasos anteriores.
Además, se requiere especial cuidado en varios pasos de este modelo. Cuando se usa sharp-curvado-dentado fórceps u otros instrumentos quirúrgicos para exponer el nervio óptico, el cirujano debe evitar fuerza excesiva, ya que puede dañar el nervio óptico, globo ocular o la arteria oftálmica, dando por resultado lesión primaria y la isquemia retiniana. Además, los vasos sanguíneos que rodean el ojo si no se daña, para evitar sangrado sostenido, que podría conducir a la falta de modelado. El IASS utilizado en este experimento requiere uso delicado. Cuando el nervio óptico se coloca dentro de la ranura del instrumento, el nervio óptico y la superficie acanalada deban montarse firmemente para asegurar buena consistencia y repetibilidad de cada modelo animal. Con la práctica, el procedimiento quirúrgico completo puede completarse en 15-20 minutos por ojo, después se hicieron los cortes de entrada inicial.
Wang et al. 19 publicado un modelo animal similar de transección parcial del nervio óptico con una amputator cuantitativa del nervio óptico. Los procedimientos quirúrgicos incluyen: 1) aparte de la corte el ángulo del ojo externo, suspensión y fijación palpebral superior; 2) explorando el nervio óptico y transecting la porción superior del nervio óptico mediante el Amputador; y 3) sutura de la conjuntiva y la piel. Aunque el procedimiento quirúrgico era relativamente simple, los siguientes problemas fueron encontrados durante la operación. Aunque la incisión lateral del ángulo del ojo podría exponer cierto espacio para la operación, había una necesidad inevitable para estirar constantemente el globo ocular con el fin de exponer la vaina del nervio óptico retrobulbar, especialmente cuando los cirujanos deseaban exponer un largo retrobulbar vaina del nervio óptico para facilitar la envoltura de aislamiento; la fuerza para estirar el globo ocular era mayor, que es probable causar lesión directa tracción del globo ocular y nervio óptico. No hay especial atención a los vasos sanguíneos que podría cortar junto con la vaina del nervio óptico, y daño a los vasos sanguíneos es probable que conduzca al establecimiento del modelo fallido. Los procedimientos principales de lesión secundaria modelo descrito en este documento son: un operario nuevo enfoque de la pared orbital lateral del globo ocular directamente acceso nervio óptico retrobulbar rodeado por el cono del músculo orbital, evitando la lesión primaria a la globo ocular y nervio óptico, al tirar hacia abajo o hacia el lado lateral nasal del globo ocular. Este nuevo enfoque operativo aumenta el espacio de operación quirúrgica en el modelado y permite fácil aislamiento de la envoltura meníngea, que está estrechamente relacionada con la arteria oftálmica, antes de la transección parcial del nervio óptico. Transección parcial del nervio óptico fue realizada con un instrumento quirúrgico diseñado, que es rentable y reutilizables, reduce el costo total de modelado. Estructura orbital de la rata es diferentes a los de otros mamíferos, con la órbita más cercana al ángulo del ojo y ninguna estructura ósea, pero cubierto de músculos. El acercamiento quirúrgico podría llegar a la parte posterior del globo ocular sin la necesidad de destruir el hueso orbital y el periostio. A través de la estricta desinfección preoperatoria y profilaxis antibiótica postoperatoria, infección, inflamación y edema fueron reducidos grandemente.
Diseño instrumento de ayudante quirúrgico
El modelo de la rata de transección parcial del nervio óptico se estableció utilizando el instrumento diseñado asistente quirúrgico, cuyas principales características son las siguientes. Puede ayudar en corte transversal cuantitativo parcial del nervio óptico, expuesto al borde acanalado, asegurando consistencia de corte transversal entre los diferentes animales. Había probado y había verificado la repetibilidad del establecimiento modelo con IASS. El máximo coeficiente de variación fue de 1,85%, con un valor promedio 0.67% ±0. 44%. 20 estos resultados indican que el IASS podrían utilizarse para establecer modelos de transección parcial del nervio óptico, con reproducibilidad satisfactorio y uniformity.
Ancho de la superficie acanalada y el diseño del semicírculo de la superficie interna de la ranura pueden tener un efecto más fijo en el nervio óptico y hacer la superficie acanalada y nervio óptico fije más firmemente, también está disminuyendo errores experimentales y reacciones adversas. La muesca permite una mejor protección del nervio óptico en el surco durante la operación, que no va a dañar el nervio óptico en la ranura, independientemente de la nitidez de la cuchilla. Otra ventaja de la muesca es prevención de lesiones de aplastamiento durante la transección del nervio óptico.
Es apropiado para operar en espacio profundo y estrecho. Aunque el nuevo enfoque operativo se ha ampliado, la vía sigue siendo profunda, y el poste de mano y de la articulación pueden utilizarse para colocar el cabezal ranurado fácilmente debajo de la vaina del nervio óptico para realizar operaciones de seguimiento. Cuando el instrumento se utiliza para la operación, puede utilizarse una amplia gama de cuchillas de corte transversal, por ejemplo, una punta de la aguja de 26 G. Incluso un cuchillo del zafiro sonda quirúrgica se puede seleccionar para evitar la contusión y lesiones causadas por tijeras de aplastar. Superficies de surco se pueden hacer en diferentes profundidades verticales para completar diversos grados de corte del nervio óptico.
Comparado con el Amputador de Wang et al. el IASS tiene una estructura más simple. Además, el paso de corte es más conveniente usar el IASS, con mayor consistencia y repetibilidad del modelo animal. Finalmente, también es más amplia la gama de herramientas aplicables para el corte con el IASS. En conclusión, IASS, que hacen incisiones cuantitativos y uniformes del nervio, pueden servir como un instrumento eficaz para el establecimiento de modelos de ratón para evaluar la transección del nervio óptico.
Características del modelo de transección parcial del nervio óptico de rata
El modelo de transección parcial del nervio óptico es útil para evaluar la degeneración secundaria en RGCs. El mérito potencial de este modelo es la capacidad de separar primaria de la degeneración secundaria exactamente en situ, tanto en el nervio óptico y la retina. Los nervios ópticos ventrales y central eran más susceptibles a la lesión secundaria después de la transección parcial (aproximadamente 1/3 a 1/2) del dorsal del nervio óptico (figura 6). En la retina, la localización regional de las lesiones primarias y secundarias de RGCs debe basarse en la topografía del nervio óptico correspondiente a RGCs retinianas después de la transección parcial. Si la retina entera de la rata se divide en dorsal (superior) y ventrales (inferiores) partes, lesiones primarias y secundarias están presentes en ambas partes. Sin embargo, basado en la relación entre RGCs en la retina y el axón del nervio óptico, muerte grave en la retina ventral debe ser principalmente atribuida a lesión secundaria (figura 3). 12 , 22 , 23 las ventajas de la inclusión de este modelo: instrumento simple y fácil de operar con procedimientos estándar; ningún efecto sobre los vasos oftálmicos; buena reproducibilidad y estabilidad. Esta técnica podría utilizarse para transfectar RGCs de este acercamiento operativo de ahorro de espacio mediante la aplicación de short interfering RNAs RNA (siRNAs), plásmidos, y tocón de vectores virales para el parcial del nervio óptico; Además, los reactivos podrían ser colocados en el tocón parcial del nervio óptico para el tratamiento selectivo o etiquetado de RGCs.
General, primarias y secundarias lesiones de RGCs coexistieron después de la transección parcial del nervio óptico en este modelo animal, con un límite claro en la retina entre los tipos de dos lesiones. Aunque la Asociación de axones del nervio óptico y la situación grave en la retina necesita más investigación para una distinción más precisa, este acercamiento operativo de ahorro de espacio se extiende el campo de aplicación del modelo y permite a los investigadores explorar la mecanismos de lesión secundaria en RGCs en una nueva forma.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias naturales de Beijing (7152038), los fondos de Investigación Fundamental para las universidades Central de la Universidad del Sur Central (2016zzts162) y la ciencia investigación Fundación de Aier ojo grupo hospitalario (Grant no. AF156D11). Por último, Fancheng Yan gracias Yiping Xu por el invaluable apoyo durante los años.
Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
Fluorogold | Biotium | 80014 | |
Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |