자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

1. 임신 연구 및 방법의 정의 (그림 1: A 파트) 참고: 최적화 목표의 정의: 필요한 제품 형성의 시간 과정 또는 단지 제한 된 시간 간격 또는 심지어 고정된 시간 포인트 관련? 또한, 안정성, 분석 정량화, 또는 재배 시간 노력 같은 잠재적인 문제를 고려 하십시오. 최종 단백질 titer 하는 대신, 다른 목표는 바이오 매스 또는 재배 시간 간주 될 수 있습니다. 바이오 매스 재배 시간 공간 시간 항복 하 여 반영 하는 동안 바이오 매스 특정 제품 수율에 의해 반영 된다. (최소) 제품의 품질 또한 목표 수 있습니다. 언급 했 듯이 다른 곳40다 객관적인 최적화, 특정 상황에 필요할 수 있습니다. 이 연구에서 재배의 17 h 후 GFP titer 최적화 목적으로 선택 되었다. GFP 형광 온라인 모델 단백질의 농도 결정 단순화이 연구에 사용할 수 있는 장비를 사용 하 여 다음 수 있습니다.참고: 정의의 매개 변수 최적화를: CgXII 매체 16 개별 구성 요소41 이루어져 있고 216 ≈ 65000 실험 결과 완전 요인 설계에서이 모든 조사. 따라서, 검색 공간 합리적이 고 경험 기반으로 감소 될 필요가 있다. 미디어 구성 요소 최적화에 대 한 고려의 선택 가능한 전문 지식 또는 문학 데이터 지원할 수 있습니다. 결정 하는 중간 구성 요소 농도 변화 하지 해야. CgXII 매체의 최적화에 대 한 다음 구성 요소는 고정 선정 되었습니다. 포도 당 10 g/l.에 고정 이 최적화는 더 많은 포도 당 생성 더 GFP 바이오 매스를 은닉 하기 때문에 사소한입니다. 목표 비 직관적인 중간 효과 공개 했다. 3-(N-morpholino) propanesulfonic 산 (MOPS) 42 g/l.에 고정 이 일괄 처리 재배 하는 동안 충분 한 완충 용량을 제공 하 고 대사 하지.참고:이 최종 농도에서 MOPS 추가 하면 추가, 다른 재고 솔루션의 다른 볼륨으로도 pH 7의 시작 값 pH 7에 되지 않은. 그러나, 시작 하는 pH 값에 대 한 편차를 제외 하려면 pH 중간 컴포지션의 모든 재고 솔루션 그들의 최대 및 최소 볼륨에 추가 됩니다 확인 되어야 한다. KH2포4 와 K2HPO4 1 g/L 각에 고정 됩니다. 이들은 또한 완충 용량을 제공 하 고 인산 염의 근원으로 봉사. 요소는 5 g/l. 고정 이 기저 질소 소스 및 pH 안정화 에이전트, N-제한 방지 하기 위해 충분 한 제공 합니다. Biotin 0.2 mg에서 고정/L. C. glutamicum ATCC13032 biotin에 대 한 auxotrophic. Protocatechuic 산 (PCA)는 30mg/l. 고정 그것은 한 철 킬레이트 화 에이전트 역할을 합니다. 이 소 프로필-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 100 µ M에 고정 됩니다. 그것은 gfp 유전자의 표정을 유도 한다. 높고 낮은 농도 초기 감도 검 진에 대 한 미디어 구성 요소를 선택 합니다. 여기에, 3 개의 일반적인 그룹 미디어 구성 요소에서에서 구성 요소 선택 되었다. 각 구성 요소에 대 한 조사 낮고 높은 농도: 표준 질소 소스: (NH4)2등4 (8-32 g/L); 질소 소스의 변형 바이오 매스 관련 GFP 신호8의 최적화를 위한 유망한 것으로 알려졌다. 추적 요소: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0.4-1.6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (125-501 µ g/L), NiCl2 ∙ 6 H2O ( 8-32 µ g/L) CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µ g/L). 성분의 구성 CgXII 중간41의 첫번째 간행물에서 상속 됩니다. 또한, 총2MoO4 ∙ H2O (26-104 µ g/L)와 H3보3 (20-80 µ g/L) CgXII 중간42의 게시 된 변형에 사용 하는 추적 요소로 포함 됐다. 매크로 요소: MgSO4 ∙ 7 H2O (0.2-0.4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21.2 mg/L). 이러한 C. glutamicum 스트레인 R 다른 중간 배경과 CgR0949 문신 신호 펩 티 드와 함께 사용 된 다른 연구14, 분 비 GFP 생산을 향상 시키기 위해 다른 divalent 양이온 중 발견 됐다. 준비 재료와 정의 절차참고: 그것은 정의 하 고 실험 방법을 상세한 수준에서 수정 좋습니다. 이 규격화는 다른 결과 추적 될 수 있다 다시 본질적인 생물학적 다양성 또는 다른 중간 작곡을 보장 합니다.참고: 미디어 솔루션 주식: 개별 재고 솔루션을 준비 하는 모든 미디어 구성 요소를 조사. 모든 구성 요소에 대 한 각기 다른 볼륨의 희석 수 있도록 농축된 주식을 준비 합니다. 즉, 디자인 계획에 따라 그들의 높은 볼륨에서 모든 재고 솔루션을 결합, 후이 최종 재배 볼륨, cf. 단락 “중간 재고 솔루션 pipetting 목록의 세대” 단계 1.3.3 초과할 수 없습니다. 경우 매우 집중된 솔루션의 추가 매우 낮은 추가 볼륨, 예: < 최종 재배 볼륨의 1/100번째 따라 재고 솔루션을 희석. 예를 들어,이 연구에서 10 µ L의 pipetting 볼륨 실현 되도록 정의 되었다. 일반적으로, 추적 요소 솔루션은 높은 집중으로 1,000fold 매체에 최종 표준 농도 관하여. 그것은 농도 참조 제조 법에 대해 배수 (X 배)로 미디어 구성 요소를 집중을. 이렇게 함으로써, 소수 자릿수 실행 불가능 pipetting 볼륨은 피 한다. CgXII 중간의 모든 재고 솔루션에 대 한 자세한 요리법 보충 문서에 제공 됩니다. 작업 세포 은행 (WCB)참고: 각 성장 실험에 대 한 WCB aliquot 사용 됩니다. 더 많은 aliquots가 필요한 경우 사용 100 mL 뇌 심장 주입 (BHI) 매체 당황 하 게 1000 mL 플라스 크를 흔들어 또는 글리세롤 솔루션의 추가 하기 전에 풀링된 여러 동요 플라스 크를 예방. 재조합 식 스트레인 C. glutamicum pCGPhoDBsGFP43 한 천 배지 (37 g/L BHI 파우더 20 g/L 천, 25 mg/L 대)에 한 식민지를 준비 합니다. 도금 재료 올 수 있습니다 하거나 신선한 변환 또는 cryopreserved 약 수에서.단일 식민지;의 외관까지 30 ° C에서 품 어 이것은 일반적으로 1 ~ 2 일 걸립니다. 식민지 소재와 통 플라스 크 문화 (50 mL BHI 매체 25 mg/L 대, 500 mL 당황 하 고 플라스 크, 250rpm, 떨고 직경 25 mm, 30 ° C)를 접종 하 고 품 어 하룻밤 (약 16 h). 결과 셀 서 스 펜 션의 한 볼륨 500 g/L 글리세롤 살 균 솔루션의 한 볼륨으로 결합 하 고 살 균 cryopreservation 튜브에 2 mL aliquots에서 배포. -80 ° c.에 게 MBR 재배 프로토콜참고:이 고용된 BioLector MBR 시스템에 대 한 연구, 빛 흩어져 (바이오 매스) 및 GFP 형광은 강도 측정, 할당 된 특정 한 이득 값을 필요로 하는. 높은 이득, 높은 광 신호 증폭은; 이것은 또한 왜 흩어져 빛과 형광 (거리) 임의의 단위로 측정 됩니다. 바이오 매스 및 적당 한 주파수를 흔들어 및 저장 프로세스 단계 동안 높은 바이오 매스 농도 산소 한계를 피하기 위해 볼륨을 채우는 예비 실험에서 GFP 검출을 위한 적당 한 이득 값을 결정 합니다. 고용된 재배 조건 (“Flowerplates”, 즉, 꽃 모양의 48-잘 MTPs, 1200 rpm의 주파수를 흔들어 1000 µ L, 주요 탄소 소스로 포도 당 10 g/L의 볼륨 작성) 보장 산소 무제한 경작. 볼륨을 작성 하 고 48-잘 MTPs 꽃 모양에 주파수를 떨고 다른 조합에서 결과 최대 산소 전송 속도, 데이터 시트에서에서 사용할 수 있습니다. 또한, 개별 문화의 성장 결함 보조 기판 (예:질소, 미 량 원소)의 낮은 금액으로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서, 경작의 끝에서 바이오 매스 농도 확인 합니다. 본이 연구에서는 이러한 성장 효과가 관찰 되었다. 다음과 같이 MBR 시스템 (“BioLector”)에 대 한 재배 프로토콜 정의. Filterset 1: 바이오 매스, 14를 얻을. Filterset 2: pH, 이득 사전 설정입니다. Filterset 3: pO2, 이득 사전 설정입니다. 4: GFP, 80를 얻을. 진동 주파수: 1200 rpm. 온도: 30 ° c. 주기 시간: 15 분. 실험 시간: 수동 (재배 하지 중지 됩니다 자동으로). 중간 재고 솔루션 pipetting 목록 생성참고: 거의 모든 액체 처리 로봇 시스템은 pipetting 작업 외부 파일에서 읽을 수 있습니다. 기본적으로, 필요한 최소한의 정보 전송 볼륨 및 시 약 소스의 위치 뿐만 아니라 로봇 갑판에는 기구 내의 특정 구멍 기구 위치 나타내는 각각의 대상 이다. 그러나, 다른 액체 처리 시스템에 대 한 다른 구문 고려 되어야 한다. 그림 2 는 본이 연구에서는 고용된 pipetting 시스템에 대 한 예제 파일 구조를 보여준다. 네 가지 유형의 재고 솔루션은 각 재배에 잘 pipetted: 미디어 구성 요소 솔루션을 재고 (“변형 주식”) 다양 한. 물 위의 주식의 다른 누적 볼륨에 대 한 보상. 해결 된 모든 구성 요소가 포함 된 재고 솔루션 (“나머지 주식”) 이 재고 솔루션을 포함 하는 다른 주식에서 구성 될 수 있습니다 구성 요소, 예를 들어, 서로 다른 온도에서 저장 또는 다른 방법으로 소독. Inoculum 마지막 구성 요소로 추가 하 고 셀의 정착 피하기 위해 또한 전에 그냥 테이블에 넣어 합니다. 재배 당 잘, 모든 미디어 구성 요소에 따라 전송 볼륨 계산: 추가할 특정 변형 주식 아마 0, 즉,이 특정 구성 요소를 생략 하는 경우 볼륨. 모든 계산된 볼륨 V나 적당 한 숫자에 대 한 수정. 볼륨 단계에 pipetting 볼륨 증가 너무 작은 해서는 안됩니다. 필요한 경우 변형 주식의 농도 조정 합니다. 예를 들어, 여기에 최소한의 pipetting 볼륨 10 µ L로 정의 했다 그리고 최소한의 증가 5 µ L로 정의 했다. 일반적으로, 이러한 볼륨 실험적으로 결정된 정밀도 처리 역15,44사용된 액체에 따라 정의 되어야 한다. 나머지 재고 모든 우물에 대 한 고정 된 구성 요소를 포함 하는 것은 다음과 같이 볼륨을 계산: 어디 변형 주식의 최대 누적 볼륨 사용 됩니다. 따라서, 다음과 같이 고정된 된 나머지 부품의 필요한 농도 계산. 그에 따라 나머지 주식 을 준비 합니다. 재배 당, 다음과 같이 추가할 수 물의 볼륨 계산: 잘 재배 당 추가의 다음 순서로 추가 될 모든 볼륨 나열: VH2O, VRestStock, Vi, VInok. 그림 2에서 예제와 같이 역을 처리 하는 액체의 사양에 따라 pipetting 목록 서식을 지정 합니다. 씨 문화, 자동화 된 미디어 준비 및 주요 문화의 시작 액체 처리 로봇에 대 한 프로토콜을 만듭니다. 해당 “WinPREP” 소프트웨어에 구현 된 “야누스” 시스템에 대 한 예제 프로토콜에 대 한 그림 3 및 그림 4 를 참조. 프로토콜은 다음과 같은 측면을 고려해 야: 미디어 준비 전에 살 균 주택의 충분 한 런타임을 포함 합니다. 초기 과도 한 청소 및 모든 pipetting 팁의 세척 및 튜브 포함. 재고 솔루션에 대 한 적절 한 기구 컨테이너를 선택 합니다. 모든 8 개의 pipetting 팁 잘 열에 병렬 배열에서 찍어 수로 여기, 12 열 깊은 잘 격판덮개 변화 주식, 저장을 위해 적당 하다. 이 크게 미디어 준비 속도. 15 mL 또는 50 mL 시 튜브 공기 통으로 사용 하는 경우 한 번에 하나만 pipetting 팁 그것에 찍어 수 있습니다.이러한 재고 솔루션 요구에 더 높은 볼륨 물과 나머지 사진같은 다른 주식에 대 한 100 mL 골짜기 사용 됩니다. 각 재고 솔루션 폐기물 볼륨, 높이 pipetting 오프셋에 대 한 보상에 대 한 충분 한 총 볼륨 제공 이 단계 씨 문화 절차 직전 실시는 보장 접종 단계 전에 사용자 프롬프트를 삽입 합니다. 적절 한 컨테이너, 예를 들면, 살 균 15 mL 및 50 mL 시험관에서 사용까지 살 균 방식으로 저장소에 모든 재고 솔루션을 준비 합니다. 70% 에탄올 및 후속 층 류 두건에 건조을 닦아 하 여 재고 솔루션 저장소 작업 테이블, 예를 들어에 대 한 깊은 잘 격판덮개를 소독. 접종 50 mL BHI 매체 WCB에서 한 약 수와 25 mg/L 대를 포함 하 여 씨 문화를 시작 합니다. MBR 재배 전에 충분 한 양의 씨 문화를 기 하 급수적으로 성장에서 신선 하 고, 중요 한 inoculum을 준비 합니다. 로봇 작업 테이블에 모든 필요한 기구를 배치 하 고 해당 기구에 재고 솔루션을 붓는 다. 마지막 단계 (접종), 씨앗 문화의 시작 시간에 도달 되도록 미디어 준비를 위한 로봇 워크플로 시작 합니다. 총 로봇 워크플로 런타임 이전에 평가 될 필요가 있다. 여기, 총 런타임 1.5 h 약 했다. 약 2 시간 후 각 시간 성장을 광학 밀도 (OD600)에 의해 모니터링 하 씨 문화를 샘플 합니다. 후 약 5 h 문화 3-4 세600 를 도달 하 고 주요 문화를 예방 하는 데 사용 됩니다. 씨 문화를 액체 처리기 작업 대에 놓고 미디어 준비 프로토콜을 계속 합니다. 접종 후 재배 MTP 인감. BioLector 장치에서 봉인된 재배 MTP를 놓고 미리 정의 된 재배 프로토콜을 시작 합니다. Biosafety 규정 필요 하다 면, 나머지 재고 솔루션을 처분 하 고 로봇 작업 테이블에서 문화 씨앗. 재사용 가능한 기구를 청소 하 고 액체 처리기 오염 프로토콜을 시작 합니다. 제품 정량화 그리고 분석에 대 한 원시 데이터의 전처리 17 h 런타임 후 주요 문화를 중지 합니다. 제조업체의 설명서에 따라 BioLection 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 연결 된 컴퓨터에 BioLector MBR 장치에서 측정 데이터를 전송. 사용에서 “데이터 관리 → 데이터 변환” 쉽게 액세스 스프레드시트 형식으로 원시 데이터 파일을 변환할 MBR 시스템을 함께 제공 하는 “BioLection” 소프트웨어 패키지의 기능. 17 헤 식별 기준 재배 우물과 평균에서 신호는 GFP에 가장 가까운 타임 스탬프 열에서 모든 재배 우물 GFP 신호 데이터를 복사 합니다. 평균 기준 신호에 의해 모든 나머지 GFP 신호를 정상화. (필요한 경우)에 추가 메서드를 사용 하 여 GFP titer를 계량 Prelabeled 반응 튜브에 모든 재배 우물에서 셀 정지를 전송 하 고 최대 속도 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 10 분 동안 원심 분리 후 셀 무료 상쾌한. 투명 한 바닥, 블랙 96 잘 MTP에 각 셀 무료 상쾌한의 200 µ L를 전송 하 고 488/520에서 GFP 특정 형광 읽기 nm 적절 한 microplate 리더를 사용 하 여. 모든 우물에서 GFP 신호 단계 1.5.3 에서처럼 참조 경작에서 평균 신호를 정상화.참고: 절대 GFP 형광 신호 다른 측정 장치에 대 한 비교 될 수 없습니다. 따라서, 모든 주요 경작에서 5 참조 종자 내부 표준으로 제공합니다. GFP titer의 개선 내부 표준에 관하여 표현할 수 있습니다. 이로써 다양 한 실험과 다른 GFP 정량화 방법 (다음 두 단계를 참조)에서 결과의 비교. 표준 프로토콜, 예를 들면, 브래드 퍼 드 또는 BCA 분석 결과 셀 무료 supernatants의 단백질 함량을 결정 합니다. 단계 2에서에서 결과 함께, 특정 단백질 GFP titer의 결정이 가능 하다.참고: 형광 측정 후이 미 판에서 직접 샘플을 사용 합니다. 멀티 채널 펫의 사용은 크게 필요한 액체 단계를 처리를 지원 합니다. SDS 페이지 시각화를 수행 셀 무료 supernatants의 증가 단백질 함량의 대부분을 확인 하는 표준 프로토콜입니다 증가 GFP 분 비 때문.참고: SDS 페이지는 특히 높은 샘플 부하와 함께 이전에 언급 한 방법 보다 더 힘 드는입니다. 확인을 위해, 그것은 종종 참조 중간 및 최종에서 셀 무료 supernatants의 SDS-페이지 최적화 중간 지켜온15실행 충분 합니다. 2. 민감도 분석 (그림 1: 부품 B) 참고:이 부분의 목표 목표에 중요 한 영향을 미칠 중요 한 요소를 식별 하는. 미디어 구성 요소의 초기 농도 범위를 선택 합니다. 참조 중간 구성 선택한 농도 범위 안에 속여야 한다. 적절 한 DOE를 선택 합니다. 이러한 디자인은 문학, 예를 들면, 통계적 방법 (www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm에서 사용 가능)의 NIST/SEMATECH 전자 수첩에서 찾을 수 있습니다. 선택한 디자인 관심의 미디어 구성 요소 수에 따라 달라 집니다 (여기, 11)와 수행된 실험 (여기, 32). 주어진된 예제에서 디자인 “2411-6” 32 실험 결과 관심의 목표에 11 구성 요소 중의 농도 증가의 효과의 추정 수 있도록 선택 되었다. 좀 더 구체적인 수, 주요 효과 쌍 단위 요소 상호 작용으로 하지 혼동 됩니다. 그러나 그들은 더 높은 순서 대로 상호와 혼동 될 수 있다는,, 가장 가능성이 안 중요 한. 나머지 우물을 사용 하 여 (여기, 16) 공정의 재현성을 평가 하기 위해 참조 매체와 여러 복제를 수행 하기 위한. 복제 위치 효과를 접시에 동등 하 게 걸쳐 한다. 참고 실험에서 측정 된 출력의 의미 값 정규화에 사용 됩니다. 즉, 각 측정된 출력 민감도 분석의 기준 출력의 평균 값으로 나누어져 있습니다. 주요 계산 가능한 경우 조합 효과 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 고. 실험의 고전적인 디자인 다항식 근사45를 기반으로 합니다. 예를 들어, MATLAB 함수 mvregress 다항식 계수 추정에 대 한 사용할 수 있습니다.Mvregress 함수는 통계 및 기계 학습 도구 상자의 일부입니다. T검정을 사용 하 여 목표에 다양 한 미디어 구성 요소 관련 효과 식별 합니다. 예제에서는 NH4+ 상당한 부정적인 효과 있으며 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 강한 긍정적인 효과 (그림 5)를 보여 줍니다. 그것의 중심 값에서 특정 구성의 집중 증가 계수 GFP 신호에 평균 상대 변화를 나타냅니다 GFP 신호 표준화 했다, , 최대 값. 관련 효과 없이 고정된 구성 요소는 최적화 하는 동안 자신의 참조 값에 있습니다. 3. 반복 최적화 (그림 1: 부분 C) 참고: MATLAB 도구 KriKit 해석 및 통계 데이터 분석36위해 사용 되었다. KriKit 사용자를 데이터 구동 Kriging 모델을 만들 수 있습니다. 이 Kriging 모델 미디어 구성 요소와 목표 간의 기능 관계를 예측합니다. 또한 예측 불확실성에 대 한 정보를 제공합니다. 높은 불확실성 시끄러운 데이터 및/또는 부족 한 데이터 밀도 나타냅니다. 미상참고: 새로운 실험은 반복적으로 설계, 이전 실행의 결과에 따라. 첫 번째 반복에서 새로운 디자인 실험 확인 된 미디어의 상세한 조사에 대 한 관심의 구성 요소. 부품 관련 효과의 농도 지금 각 참조 값을 고정으로 반복 최적화 (제 3), 제 2에서 실험 결과 전송할 수 없습니다. 따라서, 민감도 분석 및 반복적인 최적화 실험 비교 되지 않습니다. 그렇지 않으면, 그림 1, 프레임 “반복 최적화”에서 설명 하는 스키마를 따릅니다. 최적의 잠재력 정의 된 농도 범위 안의 경우, 새로운 실험 설계 되었습니다 예상된 향상 률40,46을 사용 하 여. 예상된 향상 률에 따라 실험 설계 KriKit 도구에 통합 된다. 최적 경계에 속 인 다, 농도 범위를 확장 합니다. 섹션 2에 정의 된 실험 방법에 따라 디자인 된 샘플 포인트에서 실험을 수행 합니다. 통계 분석 Kriging 모델 현재를 포함 하 여 모든 반복에서 결합 된 데이터를 사용 하 여 구성 합니다. 시각화 KriKit (2/3D 보간, 영화 분석, 상영 작, 등)의 포괄적인 도구를 사용 하 여 모델 출력을 조사 합니다. 최적의 지역 충분 한 정확도로 추정 되었다, 최적화 중지. 그렇지 않으면, 단계 3.1 계속.참고: 그림 6 에서는 시험 연구에 대 한 반복 최적화를 보여 줍니다. 농도 범위는 고원 (반복 1-6) 발견 될 때까지 연속적으로 확장 되었다. 7 반복 자세히 경계를 탐구에 대 한 사용 되었다. 4. 결과의 확인 (그림 1: 파트 D) 참고: 마친 후 반복 최적화, 초기 가정 유효성 검사를 해야 합니다. 최적의 매체 구성에 대 한 민감도 분석 (제 2)를 다시 실행 합니다. 즉, 그림 1 (C 파트)에 조사 하는 구성 요소의 농도 최적의 값으로 고정 됩니다. 다른 부품의 농도 적절 한 DOE에 따라 다양 합니다.참고: 두 검 진에서 유사한 결과 조사 구성 요소 농도 다른 부품의 영향을 변경 하지 나타냅니다. 심사 파트 B에서에서 결과에 큰 차이가 표시, 변경 효과가 구성 요소 조사 구성의 풀에 추가 해야 하 고 부품 C를 반복 해야 합니다. 간접 측정 (예를 들어, 제품 농도 대 한 지표로 형광), 경우에 직각 측정 방법 (예를 들어활동 분석 결과, 브래드 퍼 드 또는 BCA 단백질 정량화, SDS 페이지) 변경을 확인 하 적용 참조 매체 및 최적화 된 중간15결과를 비교 하 여 관심의 목적.