利用自动 Microbioreactor 技术优化异种蛋白质生产的通用协议

1. 构思方法的研究和定义 (图 1: A 部分) 注: 优化目标的定义: 是产品形成所需要的时间过程, 还是仅仅是一个有限的时间间隔, 甚至是一个固定的时间点相关？此外, 考虑潜在的问题, 如稳定性, 努力的分析量化, 或培养时间。作为最终蛋白质滴度的替代品, 其他的目标可以被考虑, 如生物量或栽培时间。生物量是由生物量特定的产品产量反映出来的, 而栽培时间则反映在 space-time 产量上。(最小) 产品质量也可能是一个目标。在某些情况下可能需要多目标优化, 如在其他地方所讨论的那样40。本研究选取 17 h 培养后的 GFP 滴度作为优化目标。GFP 荧光可以使用本研究中的设备在线跟踪, 这大大简化了模型蛋白的浓度测定。注: 要优化的参数定义: CgXII 介质由16个单独的组件41组成, 在完整的阶乘设计中调查所有这些内容将导致 216 ≈6.5万实验。因此, 需要在合理和经验驱动的基础上减少搜索空间。为优化考虑的媒体组件的选择可以得到可用的专家知识或文献数据的支持。 确定哪些中等组分浓度不应变化。为了优化 CgXII 介质, 选择了以下组件进行固定: 葡萄糖固定在10克/升。这种优化是微不足道的, 因为更多的葡萄糖产生更多的 GFP 分泌生物量。目的是揭示直观的媒介效应。 3-(n-吗) 磺酸 (拖把) 固定在42克/升。这提供了足够的缓冲能力, 在间歇培养, 并没有代谢。注: 在这最后的浓度添加拖把确保了 ph 值 7, 即使与其他股票解决方案的不同体积添加, 这不是在 ph 7。但是, 要排除起始 ph 值的任何偏差, 应检查所有库存溶液在其最大和最小体积上添加的介质成分。 2PO4和 K2HPO4分别固定在1克/升。这些也提供缓冲能力, 并且作为磷酸盐来源。 尿素固定在5克/升。这是一个基础氮源和 pH 稳定剂, 足以防止 n-限制。 生物素固定在0.2 毫克/升.谷氨酸ATCC13032 是生物素的缺陷。 儿茶酸 (PCA) 固定在30毫克/升。它充当铁螯合剂。 Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 固定在100µM。它诱导了gfp基因的表达。 选择高和低浓度的介质元件进行初始灵敏度筛查。在这里, 选择了三典型的媒体组件组的组件。被调查的低和高集中为每个组分是: 标准氮源: (NH4)2所以4 (8-32 克/升);据报道, 氮源的变化有望优化生物质特异性 GFP 信号8。 跟踪元素: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 毫克/升), MnSO4 ∙ H2o (4-16 毫克/升), ZnSO4 ∙ 7 H2o (0.4-1.6 毫克/升), 丘索4 ∙ 5 h2o (125-501 µg/升), NiCl2 ∙ 6 h2o (8-32 µg/升) 和 CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µg/升)。跟踪元素的组成是从 CgXII 媒体41的第一个发布继承的。此外, Na2MoO4 ∙ h2O (26-104 µg/l) 和 h3BO3 (20-80 µg/升) 作为跟踪元素包括在内, 因为它们在 CgXII 介质42的已发布变体中使用。 宏元素: MgSO4 ∙ 7 H2O (0.2-0.4 克/升), CaCl2 ∙ 2 H2o (5.3-21.2 毫克/升)。这些被发现在其他价阳离子增加分泌 GFP 生产在另一项研究14中, 其中C. 谷氨酸应变 R 使用了不同的介质背景和 CgR0949 达信号肽。 材料的准备和定义程序注意: 建议在详细的层次上定义和修复实验方法。这种标准化确保了不同的结果可以追溯到内在的生物变异或不同的培养基组成。注: 媒体库存解决方案: 为所有已调查的媒体组件准备单独的库存解决方案。准备高度集中的库存, 以便为所有部件稀释不同的体积。这意味着, 在根据设计计划将所有库存解决方案合并为最高容量后, 这不能超过最终的培养量,参见第 “生成中型股票解决方案移列表” 步骤1.3.3。如果添加高度集中的解决方案会导致非常低的添加量, 则如和 #60; 1/100) 最后培养量的th , 相应地稀释了库存溶液。例如, 在本研究中, 移体积小于10的µL 被定义为不可行。通常, 在介质中的最终标准浓度方面, 痕量元素溶液的浓缩程度与1,000fold 一样高。将介质成分作为倍数 (X 倍) 集中在参考配方中是有利的。这样, 就避免了小数小数的不可行移卷。CgXII 介质的所有库存解决方案的详细食谱载于补充文件。 工作细胞银行 (WCB)注: 对于每个生长试验, 使用一个 WCB 分。如果需要更多的等分, 使用100毫升脑心灌注 (BHI) 培养基在1000毫升的困惑摇瓶或接种多个摇瓶, 这是汇集之前加入甘油溶液。 制备重组表达式菌株的单菌落C. 谷氨酸pCGPhoDBs-GFP43琼脂板 (37 克/升 BHI 粉, 20 克/升琼脂, 25 毫克/升卡那霉素)。电镀材料可以是来自新鲜的转变或从冷冻分。在30° c 孵育直到单一菌落的出现;这通常需要一到两天。 接种摇瓶培养液 (50 毫升 BHI 培养基, 25 毫克/升卡那霉素, 500 毫升折流板烧瓶, 250 rpm, 25 mm 晃动直径, 30 ° c) 与菌落材料和孵化过夜 (约 16 h)。 结合一体积的结果细胞悬液与一卷500克/升无菌甘油溶液和分布在2毫升等分无菌冻存瓶。贮存在-80 ° c。 MBR 栽培协议注: 对于受雇的 BioLector MBR 系统在本研究中, 散射光 (生物量) 和 GFP 荧光是强度测量, 需要一定的增益值分配。增益越高, 光信号放大越高;这也是为什么散射光和荧光以任意单位 (a.u) 来测量的原因。在初步实验中, 确定适当的生物量和 GFP 检测的增益值, 以及适当的震动频率和填充量, 以避免在以后的工艺阶段较高的生物量浓度的氧气限制。被雇用的耕种情况 (“Flowerplates”,即, 花形48井台胞, 震动频率1200转每分钟, 装填容量1000µL, 10 克/L 葡萄糖作为主要碳来源) 保证氧气无限制的耕种。在花形48井台胞中, 由于其他组合的灌装容积和震动频率的影响, 可获得最大的氧气传输速率, 提供了供应商的数据表。另外, 由于次级基质含量低 (例如、氮、痕量元素), 个别培养物的生长缺陷可能发生。因此, 在耕种结束时检查生物量浓度。在这项研究中, 没有观察到这样的生长效应。 定义 MBR 系统 (“BioLector”) 的栽培协议如下: Filterset 1: 生物量, 增益14。Filterset 2: pH 值, 增益预设。Filterset 3: pO2, 增益预设。4: GFP, 增益80。 震动频率: 1200 rpm。 温度:30 ° c。 周期时间:15 分钟 试验时间: 手动 (培养不会自动停止)。 中型库存解决方案移列表的生成注意: 几乎任何液体搬运机器人系统都能从外部文件中读取移的操作。基本上, 所需的最小信息是试剂源的传递量和位置, 以及在机器人甲板上的实验室位置和实验室内的特定腔的目标。但是, 对于不同的液体处理系统, 必须考虑不同的语法。图 2显示了本研究中使用的移系统的一个示例文件结构。 四种类型的股票解决方案是 pipetted 到每个种植井: 各种媒体组件的库存解决方案 (“变体股票”)。 水, 以补偿不同的累积量以上的股票。 包含所有已修复组件的股票解决方案 (“剩余库存”)。此股票解决方案可以由包含不同组件的股票组成, 它们是例如, 存储在不同的温度下或用不同的方法灭菌。 接种, 应添加为最后一个组件, 并把它放在工作台上, 以避免细胞沉淀。 每种植好, 根据以下内容计算所有媒体组件要传输的卷: 为某些变体股票添加的卷可能为零, 如果省略此特定组件, 则为即。 为适当的数字修订所有计算出的卷Vi 。卷步骤中的移卷增量不应太小。如有必要, 请调整变体库存的浓度。例如, 这里的最小移卷定义为10µL, 最小增量定义为5µL。一般来说, 这些卷应该根据实验确定的精度和准确度为所用的液体处理站15,44。 计算包含所有井的固定组件的剩余库存的体积, 如下所示: 使用变体库的最大累计卷的位置. 因此, 在Rest 库存中计算固定组件的所需浓度, 如下所示: 相应地准备剩余库存。 每种植井, 计算水量增加如下: 每耕种好, 列出要添加的所有卷在以下加法顺序: VH2O, vRestStock, vi, vInok。根据液体处理站的规格格式化移列表, 如图 2中的示例所示。 种子文化、自动媒体准备和主要文化的开始 为液体搬运机器人创建一个协议。有关 “双面” 系统的示例协议, 请参见图 3和图 4 , 并在相应的 “WinPREP” 软件中实现。该议定书应考虑以下方面: 在媒体准备之前, 包括一个足够的无菌住房的运行时间。 包括初始过度清洗和清洗所有移提示和油管。 为库存解决方案选择合适的实验室容器。在这里, 有12列的深井板适用于存储变体库存, 因为所有八移提示都可以在平行排列中插入井柱。这大大加快了媒体的准备工作。如果使用15毫升或50毫升试剂管作为水库, 只有一个移的尖端可以蘸入它一次。对于其他股票如水和休息库存, 100 毫升水槽被使用, 因为这些股票解决方案需要更大的体积总量。 为每个库存解决方案提供足够的总容量以补偿废物量、高度移补偿、等 在接种步骤之前插入用户提示, 确保此步骤在种子培养过程之前立即执行。 以无菌的方式准备所有库存解决方案, 并在适当的容器中存储直到使用,例如, 无菌15毫升和50毫升试管。 在工作台上用70% 乙醇和随后的干燥方式在层流罩上擦拭深井板, 用于储存溶液贮存. 启动种子培养, 接种50毫升 BHI 培养基含有25毫克/l-卡那霉素与一个分从 WCB。在 MBR 培养之前, 从指数生长的种子培养物中充分制备新鲜、重要的接种。 将所有必要的实验室放在机器人工作台上, 并在相应的实验室中倒入库存解决方案。 启动机器人工作流的媒体准备, 使最后一步 (接种), 是及时到达与种子文化的开始。需要对机器人工作流的总运行时进行以前的评估。这里, 总运行时约为1.5 小时。 采样种子培养在大约 2 h 以后, 然后每小时, 通过光学密度监视增长 (OD600)。在大约 5 h 以后, 文化达到 3-4 OD600并且用于接种主要文化。 将种子培养置于液体处理工作台上, 并继续进行介质准备协议。海豹栽培计划在接种以后。 在 BioLector 装置中放置密封的培养计划, 并启动预定义的栽培方案。 根据生物安全法规的需要, 处理剩余的库存解决方案, 并从机器人工作台中播种。清洗可重用的实验室并启动液体处理净化协议。 用于分析的原始数据的产品量化和预处理 停止17小时运行后的主要区域性。 根据制造商的用户手册, 将测量数据从 BioLector MBR 设备传输到连接的计算机, 使用 BioLection 软件包。 使用 “BioLection” 软件包的 “数据管理→转换数据” 功能, 该软件包伴随着 MBR 系统将原始数据文件转换为易于访问的电子表格格式。从最接近17小时的时间戳柱上复制所有培养井的 gfp 信号数据, 从参考栽培井和平均值中识别 gfp 信号。通过平均参考信号正常化所有剩余的 GFP 信号。 使用附加方法量化 GFP 滴度 (如果需要) 用台式离心机将所有培养井的细胞悬浮液转化为 prelabeled 反应管, 在离心后获得无细胞上清液10分钟。 将每一个无细胞的上清液转移200µL 到一个透明的底部的黑色96井中期, 并使用合适的微阅读器在 488/520 nm 读取 GFP 特异荧光。从参考栽培的平均信号的所有井中标准化 GFP 信号, 如步骤1.5.3。注意: 对于不同的测量装置, 不能比较 GFP 荧光的绝对信号。因此, 从所有主要栽培的5参考菌株作为一个内部标准。提高 GFP 的效价可以表达与内部标准有关。这允许比较不同的实验结果和不同的 GFP 定量方法 (见下面两个步骤)。 用标准的协议,例如, 布拉德福或免疫分析法测定无细胞清的蛋白质含量。结合2步的结果, 可以确定蛋白质特定的 GFP 效价。注: 荧光测量后, 直接使用本微样品。使用多通道管大大方便了必要的液体处理步骤。 执行 SDS 页面可视化的无细胞清遵循标准协议, 以验证大多数增加蛋白质含量是由于增加 GFP 分泌。注: SDS-页比前面提到的方法更费力, 特别是在高样本载荷下。为了验证目的, 从参考介质和最终优化培养基培养15中运行无细胞清的 SDS 页往往是足够的。 2. 灵敏度分析 (图 1: B 部分) 注意: 本部分的目标是确定对目标有重大影响的重要因素。 选择介质组件的初始浓度范围。参考介质成分应位于所选浓度范围内。 选择合适的 DOE。这种设计可以在文献中找到,例如, 来自 NIST/SEMATECH 电子手册的统计方法 (可在 www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm)。选择的设计取决于感兴趣的媒体组件的数量 (这里, 11) 和执行的实验的数量 (这里, 32)。在给定的示例中, 选择了设计 “2IV11-6”, 结果在32实验中, 并允许估计增加十一个组件之一的浓度对目标感兴趣的影响。更具体地, 主要作用不混淆与对因素互作用。他们可以被混淆与高阶的互动, 但是, 很可能不显着。 使用剩余的井 (这里, 16) 执行多次复制与参考媒介评估过程的再现性。复制应该同样分布在板块上, 以发现位置效应。参考实验的测量输出的平均值用于规范化。即灵敏度分析的每个测量输出除以参考输出的平均值。 使用适当的统计软件计算主要的和可能的组合效果。经典的实验设计是基于多项式逼近45。例如, MATLAB 函数 mvregress 可用于估计多项式系数。mvregress 函数是统计和机器学习工具箱的一部分。 使用t测试标识各种媒体组件对目标的相关影响。在本例中, NH4+具有显著的负面影响, 而 Ca2 +和 Mg2 +显示了最强的正效应 (图 5)。由于 gfp 信号是正常化的, 当特定成分的浓度从其中心值增加到其最大值时, 该系数表示 gfp 信号中的平均相对变化. 在优化过程中, 没有相关效果的固定元件在参考值。 3. 迭代优化 (图 1: C 部分) 注: MATLAB 工具 KriKit 用于解释和统计数据分析36。KriKit 允许用户构造一个数据驱动的克里格模型。这种克里格模型预测了媒体组件和目标之间的功能关系。它还提供了预测不确定性的信息。高不确定度表示噪音数据和/或数据密度不足。 能源部注: 根据上一次运行的结果, 对新的实验进行迭代设计。 在第一次迭代中, 设计新的实验以详细调查已识别的媒体组件的兴趣。2节的实验结果不能转移到迭代优化 (第3节), 因为没有相关效应的组分的浓度现在被固定到相应的参考值。因此, 从灵敏度分析和迭代优化的实验是不可比拟的。 否则, 请按照图 1中所示的方案, 框架 “迭代优化”。如果潜在的优化位于定义的浓度范围内, 则使用预期的改进4046设计新的实验。基于期望改进的实验设计集成在 KriKit 工具箱中。如果最佳的是在边界, 扩大浓度范围。 根据2节中定义的实验方法, 在设计的取样点上进行实验。 统计分析 使用所有迭代 (包括当前的) 的组合数据构造克里格模型。 利用 KriKit 的综合工具 (2/3 维插值、电影分析、筛选图、等) 对模型输出进行可视化研究。 如果用足够的精度估计最优面积, 停止优化。如果没有, 请继续执行步骤3.1。注意:图 6说明了测试研究的迭代优化。浓度范围依次扩大, 直到找到一个高原 (迭代 1-6)。第七迭代用于更详细地探索边界。 4. 结果的验证 (图 1: D 部分) 注: 在完成迭代优化后, 需要检查初始假设的有效性。 重做灵敏度分析 (2 节), 以获得最佳介质成分。即, 在图 1中调查的组件的浓度 (C 部分) 被固定到它们的最优值。其他成分的浓度根据适当的 DOE 而异。注: 这两项检查的结果都表明, 被调查成分的浓度水平不会改变其他成分的影响。如果筛选显示出与 B 部分的结果有显著差异, 则应在已调查的组件池中添加具有更改效果的组件, 并且应重复 C 部分。 在间接测量的情况下 (例如, 荧光作为产品浓度的指示器), 应用正交测量方法 (如: 如, 活性测定, 布拉德福德或蛋白质定量评估, SDS 页), 以确认变化通过比较引用媒体和优化的媒体15的结果来实现感兴趣的目标。