L’obiettivo del presente protocollo è di alterare la penetranza dei fenotipi mutanti scheletrici letale in zebrafish allevamento selettivo. Mutanti letali non possono essere coltivate all’età adulta e si sono allevati, pertanto questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio e selezione penetranza attraverso più generazioni di progenie test.
Fenotipi mutanti di zebrafish sono spesso in modo incompleto con liquidi penetranti, solo che si manifesta in alcuni mutanti. Fenotipi interessanti che compaiono in modo incoerente possono essere difficili da studiare e possono portare a risultati di confondimento. Il protocollo descritto qui è un paradigma di allevamento semplice per aumentare e diminuire la penetranza nei mutanti scheletrica letale zebrafish. Perché mutanti letali non possono essere selettivamente allevati direttamente, la strategia di allevamento selettivo classico di progenie test è impiegata. Questo metodo include anche protocolli per Kompetitive Allele specifico PCR (KASP) genotipizzazione zebrafish e colorazione zebrafish larvale della cartilagine e dell’osso. Applicare la strategia di allevamento descritta qui può aumentare la penetranza di un fenotipo scheletrico interessante consentendo ulteriori risultati riproducibili in applicazioni a valle. Inoltre, diminuendo la penetranza mutante attraverso questa strategia di allevamento selettivo può rivelare i processi di sviluppo che richiedono più fondamentalmente la funzione del gene mutato. Mentre lo scheletro in particolare è considerato qui, proponiamo che questa metodologia sarà utile per tutte le linee mutanti di zebrafish.
Zebrafish è un sistema potente modello per comprendere lo sviluppo scheletrico. Con ceppi mutanti di zebrafish, biologi possono decifrare la funzione del gene durante skeletogenesis. Tuttavia, zebrafish fenotipi mutanti scheletrico possono presentare con penetranza variabile1,2,3,4 che può ostacolare l’analisi evolutiva e genetiche. Lo scopo di questo metodo è triplice. In primo luogo, generando linee mutanti di zebrafish che costantemente producono fenotipi gravi consente studi evolutivi a valle come registrazione time-lapse trapianto e5 6. Questi tipi di studi possono essere paralizzati dal tentativo di studiare fenotipi che si manifestano solo in modo incoerente. In secondo luogo, l’inbreeding zebrafish ceppi può diminuire variazione background genetico, favorendo così la riproducibilità e consistenza sperimentale. Ad esempio, corso tutti in situ analisi di ibridazione su uno sforzo selettivamente inbred possono ridurre la variabilità confondenti e rafforzare le conclusioni. In terzo luogo, generando gravi e lievi ceppi rivelerà tutta la serie fenotipica che può derivare da una mutazione particolare.
A prima vista, l’allevamento selettivo di mutanti letali sembra impossibile. Come può una razza per penetranza quando gli animali che sono segnati per la selezione sono morti? Fortunatamente, metodi di allevamento selettivo di selezione della famiglia, in particolare progenie test, hanno dimostrato efficacia in allevamento programmi per molti anni7,8. Questi programmi sono utilizzati principalmente per l’allevamento selettivo per tratti che presenti solo in uno dei due sessi, come la produzione di latte delle vacche o produzione di uova nelle galline. I maschi di queste specie non possono essere segnati direttamente, ma loro progenie sono segnati e quindi viene assegnato un valore ai genitori. Prendendo in prestito da questa strategia, il protocollo presentato qui coinvolge segnando la prole mutante fissa e macchiata da una coppia di zebrafish che sono eterozigoti per un gene mutante di interesse. La penetranza di un fenotipo nella prole mutante letale omozigotico è assegnata ai genitori quando si decide quali individui produrrà la prossima generazione in linea. Troviamo che questo metodo è un efficace mezzo di spostamento penetranza in zebrafish mutanti scheletrica letale1.
Simile ad altri studi, questo protocollo di allevamento selettivo prende sotto criteri di considerazione come la nidiata, sopravvivenza della prole, normale sviluppo di embrioni e di rapporto del sesso9. Tuttavia, questi fattori sono considerati nel contesto di uno sfondo mutante con l’obiettivo di trasferire la penetranza mutante. Pertanto, il presente protocollo estende precedenti paradigmi di allevamento selettivo, offrendo un metodo per rafforzare analisi mutante inerente allo sviluppo, nonché di aumentare l’omogeneità di fondo.
Questo protocollo richiede vasta genotipizzazione, quindi è importante sviluppare un protocollo affidabile, rapido genotipizzazione in anticipo. Ci sono molti genotipizzazione protocolli disponibili10,11, tuttavia troviamo il KASP genotipizzazione12,13,14 è più veloce, costo più efficiente e più affidabile rispetto ai metodi basato sulla fenditura di enzima di restrizione di sequenze amplificate10. Di conseguenza, includiamo un protocollo KASP in questo lavoro. Inoltre, ci concentriamo sui fenotipi mutanti scheletrici in questo protocollo e includono una procedura per colorazione modificate da precedenti protocolli15Alcian blu/alizarina rossa.
Il metodo qui descritto è una strategia semplice per letale mutante penetranza di spostamento verso l’alto o verso il basso. Mentre questo protocollo si concentra sui fenotipi mutanti scheletrici, crediamo che sarà una strategia utile per allevamento di tutte le linee di zebrafish mutanti. Infatti, l’utilità di questa strategia di allevamento probabile si estende di là di zebrafish. Prevediamo che questo protocollo può essere modificato per spostare penetranza in una vasta gamma di organismi. Lo spostamento di penetranza letale progenie test può aiutare a spingere in avanti il progresso di qualsiasi genetista inerente allo sviluppo.
Allevamento selettivo svela sottigliezze della funzione del Gene
Lo spostamento di fenotipi mutanti per essere più o meno gravi di allevamento selettivo è un modo semplice per acquisire nuove conoscenze in funzione del gene. Quando confrontato con i metodi standard di allevamento non selezionato, il protocollo qui presentato può produrre una comprensione più completa dei fenotipi mutanti. In particolare, tramite la generazione di ceppi che sono gravi, può essere rivelata …
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Chuck Kimmel per l’orientamento, John Dowd aiuto nello sviluppo di questa strategia di allevamento, Macie Walker per il suo lavoro nel perfezionare la macchia scheletrica e Charline Walker e Bonnie Ullmann per zebrafish utili consigli. Questo lavoro è stato supportato da K99/R00 DE024190 a JTN.
Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
190 proof Ethanol | |||
Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
Tricaine-S | Western Chemicals | ||
Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |