Özet

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

Published: October 20, 2017
doi:

Özet

細胞は異なる形態を表示し、様々 な彼らの隣人との相互作用を確立します。このプロトコルでは、単一細胞の形態を明らかにする、老舗の Gal4/UA 式システムを使用して、細胞間相互作用を調査する方法について説明します。

Abstract

セルには、異なる形態と複雑な解剖学的関係が表示されます。細胞彼らの隣人との対話の方法相互作用は細胞のタイプ間または特定の種類の内であっても異なる?彼らは空間のルールの種類が従うか。このような基本的な質問体内への回答は、これまでのところ高解像度 1 つのセルのラベルのためのツールの欠如によって妨げられています。ここでは、多色 FlpOut (MCFO) を用いた単一細胞をターゲットに詳細なプロトコルを提供しています。このメソッドは、3 つ異なるタグ記者 (HA、旗、V5) UA 制御の下で 2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターで静かに保管されているに依存します。熱衝撃パルスは、個々 の細胞における FRT 停止 FRT カセットをランダムに削除する熱衝撃波の Flp リコンビナーゼの発現を誘導する: 式は、GAL4 ドライバーを表すセルでのみ発生します。これは、高解像度で個々 の細胞の形態の可視化を可能にする特定の細胞型の別様に着色されたセルの配列に します。例として、MCFO 技術は大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を視覚化するための特定のグリア GAL4 ドライバーと組み合わせることができます。

Introduction

グリア細胞、神経系 (NS) の非神経細胞集団はニューロンの静的なフレームワークを提供するために長い間信じられていた、したがって詳細に至りませんでした。ただし、ヒトでは、グリアは NS (~ 90%) のセルの大部分を構成する、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト、ミクログリア、シュワン細胞を含むいくつかの異なるカテゴリに分類されます。ショウジョウバエグリアは、NS で細胞の約 10% を構成します。興味を持って、その形態と機能が脊椎動物1,2で見つけられるそれらに非常に類似します。その形態には、血液脳関門 (BBB) アストロ サイト様細胞、神経鞘、上皮形成が含まれます。

ショウジョウバエ中枢神経系 (CNS) は次の主構造体で構成されています:; 神経細胞の細胞体を含む皮質領域ハーバーのシナプス接続 neuropils接続別 neuropiles; 小規模および大規模な軸索路(図 1) 中枢神経系と感覚器官や筋肉を接続する末梢神経。すべてのこれらの解剖学的構造に関連付けられているグリア細胞が見つかった: 皮質領域、アストロ サイトのようなグリア細胞 (ALG), 脊髄グリア細胞 (EG) 構造の領域、脊髄グリア細胞の皮質グリア (CG) は中央軸索路と周辺機器に関連付けられているも神経 (EGN)、そして最後に、グリア細胞シートのような 2 つ、perineurial グリア (PG) と subperineurial (SPG)、これは一緒に全体の NS (図 2) をカバーする連続した層を形成します。

前の研究は、そのグリアを示されている; NS の開発に重要な役割を果たすインスリン様ペプチドを全身循環に反応して神経細胞の数を監視、ニューロン、グリア-ニューロン乳酸シャトルなどに栄養サポートを提供して貪食3,4で死にかけている神経細胞を排除,5,6成熟した NS でグリア BBB を維持、神経伝達物質を取るとイオンの恒常性を維持、マクロファージできません、BBB に違反し、動物の行動の6と同様、シナプスの活性を調節するので、NS で主要な免疫細胞として機能。,7,8,9,10,11

グリア細胞のサブタイプが異なるが特殊な機能を実行するかどうか重要な未解決の問題に残る。ただし、成体における特にグリア細胞の体系的なゲノム解析は、その操作に対応する遺伝的ツールの欠如によって妨げられています。ここでは、複雑な細胞間相互作用を研究するセル形状の効率的かつ簡単な評価を可能にする手法を提案します。この手法は、大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を特徴付けるに適用されていますが、ニューロン12,13 を研究に使用される特定の GAL4 ドライバー、に応じて合わせることができます。、混ざり細胞と原則としていかなる任意の発達段階内の任意組織。

Protocol

1。 多色 FlpOut (MCFO) 実験用のハエの準備 注:、MCFO 技術と呼ばれる Flp を介した停止カセット切除 (FlpOut) の修正バージョンを指します。MCFO ハエの遺伝子を運ぶ熱ショック プロモーター (hsp)-Flp リコンビナーゼや UA の下で別の記者を制御します。各レポーターから成っているエピトープ タグを 10 枚でにおける (myr) スーパー フォルダー緑色蛍光蛋白質 (sfGFP) の共通バック?…

Representative Results

このセクションでは、大人のショウジョウバエ脳における MCFO 技術を使用して得られる結果の例を示しています。メソッドの概略図を図 3に示します。3 異なる膜タグ記者 (myr smGFP HA、myr smGFP フラグ myr smGFP V5) UA コントロールの下で、2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターが黙っていた。熱衝撃パルスは…

Discussion

このプロトコルでは、高解像度で興味の組織内の別のセル型の形態を研究する簡単で効率的な方法について説明します。MCFO を用いた異なるエピトープ タグで複数の記者は多色確率ラベル (図 2) の組み合わせで使用されます。Brainbow/Flybow15,16,17などの他のメソッドと同様に、MCFO よりラベル多様化マ?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、アルニム Jenett、Aljoscha ナーンサイ、アドバイスのルービン研究室の他のメンバーと未発表試薬および共焦点画像を生成するため Janelia 飛ぶ光プロジェクト チームの共有をありがちましょう。著者も原稿のコメントをガリア研究室のメンバーに感謝します。

Materials

Water bath Grant GD100
PCR tubes Sarstedt 72.737.002
Forceps Dumont 11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate Corning 7223-34 Glass dissection plates
Sylgard Black SYLGARD, Sigma-Aldrich 805998 home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium Invitrogen 10486-025
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713
Triton X-100 Roth 3051.3
Normal goat serum Jackson Laboratories 005-000-121
Normal donkey serum Jackson Laboratories 017-000-121
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Rabbit HA-tag Cell Signaling C29F4 Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag Novus Biologicals NBP1-06712 Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549 AdSerotec 0411 Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488 Invitrogen A11034 Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647 Jackson Laboratories 712-605-153 Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield Vector Laboratories H-1000
SlowFate Gold Invitrogen S36937
Secure Seal Spacer Grace Biolabs Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm Marienfeld 101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm Roth H874
Stereo Microscope, Leica MZ6 Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710 Zeiss
Immersol Zeiss 518 F Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol Zeiss W 2010 Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG) Bloomington Stock Center 39157 GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG) Bloomington Stock Center 45914 GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 Bloomington Stock Center 64085 UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J) Image analysis software
Multi Time Macro Zeiss Software for automated scanning

Referanslar

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