Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Harris A. Weisz; Deborah R. Boone; Stacy L. Sell; Helen L. Hellmich

doi:10.3791/56134

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Nörobilim

ميكروديسيكشن التقاط المناظير باستخدام الأشعة الليزر الموجهة بأطلس الدماغ المناطق المتأثرة بالإصابات الرضية

Published: September 11, 2017

doi:

10.3791/56134

Harris A. Weisz*¹, Deborah R. Boone*¹, Stacy L. Sell¹, Helen L. Hellmich¹

¹Department of Anesthesiology,University of Texas Medical Branch

Özet

يصف لنا استخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن للحصول على عينات سكان خلية متميزة من مناطق المخ المختلفة لتحليل الجينات وميكرورنا. يسمح هذا الأسلوب دراسة الآثار التفاضلية لإصابة الدماغ في مناطق معينة من الدماغ الفئران.

Abstract

يمكن أن تعوق القدرة على عزل مناطق محددة من الدماغ لمصلحة في تقنيات قطع الأنسجة التي لا تحافظ على توزيعها المكاني. كما يحتمل أن تحرف هذه التقنيات تحليل التعبير الجيني لأن العملية نفسها يمكن أن يغير أنماط التعبير في الخلايا الفردية. هنا يمكننا وصف أسلوب ميكروديسيكشن (LCM) التقاط بشكل انتقائي جمع الدماغ محددة المناطق المتضررة جراء إصابة في الدماغ (تبي) من نسل معدلة (كريسيل البنفسجي) تلطيخ البروتوكول والتوجيهات أطلس الدماغ الفئران باستخدام ليزر. LCM يوفر الوصول إلى مناطق الدماغ في مواقعها الأصلية، والقدرة على استخدام المعالم التشريحية لتحديد الهوية لكل منطقة بعينها. وتحقيقا لهذه الغاية، استخدمت سابقا LCM لدراسة التعبير الجيني محددة منطقة الدماغ في تبي. يسمح هذا البروتوكول النظر في التعديلات التي يسببها تبي في التعبير الجيني وميكرورنا في مناطق الدماغ متميزة داخل الحيوان نفسه. يمكن تعديل مبادئ هذا البروتوكول وتطبيقها على مجموعة واسعة من الدراسات دراسة الجينوم التعبير في المرض و/أو نماذج حيوانية أخرى.

Introduction

الدماغ الثدييات معقدة وغير متجانسة مع مئات الآلاف من أنواع الخلايا¹بشكل ملحوظ. وفي الواقع، البشرية وقد أظهرت الدراسات أن في مناطق مثل القشرة الأمامية، الهيكلية وتنعكس الاختلافات الوظيفية في المسألة الأبيض والرمادي في ملامح متميزة ومتباينة النسخي². تغاير الدماغ قد يشكل عقبة رئيسية أمام تفسير البيانات التعبير الجيني وفي الميدان لإصابة في الدماغ. هذا الغموض في الدراسات الإكلينيكية أدى فيما بعد إلى المئات من فشل التجارب السريرية للعلاجات ل إصابات الدماغ³.

نحن نستخدم الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) أساليب لدراسة إصابات الدماغ الرضية (تبي)-الناجمة عن التقلبات الجينات في الفئران الدماغ⁴، مع التركيز على الحصين، منطقة الدماغ التي أساسية ل التعلم والذاكرة⁵. يعطينا القدرة على التقاط بالليزر وتحليل التعبير الجيني في الموت والباقين على قيد الحياة من الخلايا العصبية إلى فهم أكبر لدور ستوتشاستيسيتي في التعبير الجيني في تحديد النتائج (بقاء الخلايا العصبية) بعد تبي⁶. كما أثبتت تقنيات LCM مفيدة لاستكشاف آثار تبي هيبوكامبال الخلايا العصبية عند المقارنة بين الشباب والشيخوخة الفئران الفئران أو⁷ ⁸.

في الدراسات التي أجريت مؤخرا، قمنا بفحص مناطق أخرى من الدماغ الفئران تأثر سلبا على تبي، مع تركيز على المناطق في الفئران والمرضى تبي البشرية المرتبطة بالوظيفة التنفيذية (أي قشرة أمامي⁹) وكانوا تبي؛ وتشمل هذه كانوا الاكتئاب (أي نواة accumbens¹⁰) واضطرابات إيقاع circadian (نواة suprachiasmatic¹¹). في دراسات سابقة، وهووسكو وبيتكانين¹² ودريكسيل et al. ¹³ استخدم LCM لدراسة التعبير الجيني في المهاد وتحت المهاد. يبني على هذه الملاحظات السابقة دراستنا ويشمل أربع مناطق أخرى في الدماغ. من الضروري لدراسة التغيرات الجزيئية الخاصة بالمنطقة التي يسببها بعد تبي، لاكتساب الخبرة في مجال تحديد والحصول على أنواع الخلايا في هذه المناطق باستخدام نظام LCM. الليزر قطع الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء (IR) تسمح ميكروديسيكشن الدقيق لمناطق الدماغ المرجوة. وهنا يصف لنا كيف نستخدم هذا النظام LCM، تسترشد بالإحداثيات ستيريوتاكسيك في أطلس الفئران الدماغ¹⁴، لتحديد والتقاط الفئران الدماغ المناطق الأربع الأثران المتأثرة بأسلوب الإصابة التجريبية قرع سائل الدماغ بالليزر ⁴.

Protocol

ملاحظة: هي وافق جميع التجارب على الحيوانات حسب توجيهات “المعاهد الوطنية للصحة دليل” لرعاية واستخدام رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة “تكساس فرع طبية”، غالفيستون، تكساس الحيوانات المختبرية (الطبعة الثامنة، الوطني مجلس البحوث)- 1-جمع الأنسجة وتحديد المنطقة وسيكتيونينج موضوع الكبار، الذكور، سبراغ داولي “الفئران”، حوالي ستة أسابيع من العمر وز 250-300، إلى إصابة قرع السوائل التجريبية، كما هو موضح في شيمامورا et al. 4- euthanize أربع وعشرين ساعة بعد تبي التجريبية، معاملة إنسانية الحيوانات بوضعها في غرفة مع تركيز isoflurane 4% حتى عمق تخديره. كفالة الإعدام بقطع الرأس والمكوس على العقول، وتجمد فورا في الثلج الجاف المجفف. مخزن تجميد العقول في ثلاجة-80 درجة مئوية حتى تمزيقها. مسبق لأي إجراء LCM يتضمن تحليل النسخي، تنظيف جميع الأسطح مع رناسي إزالة المنظفات لتقليل مخاطر التلوث وتدهور الجيش الملكي النيبالي- ملاحظة: هذا التنظيف يشمل منطقة تستخدم لتلطيخ، كريوستات حيث هو مقطوع الأنسجة، والمنطقة المحيطة بالجهاز LCM. استرداد أنسجة المخ من التخزين ومكان إلى كريوستات تبريد إلى-20 ° السماح جيم المخ حجته إلى درجة حرارة غرفة كريوستات ~ 10 دقيقة ضع الجانب البطني الدماغ حتى على ورقة شاش على رأس مرحلة كريوستات. مع شفرة حلاقة نظيفة وخالية من رناسي، قطع قبالة الجزء الخلفي فقط روسترال إلى المخيخ (يمكن حفظ أو تجاهل) والجزء فقط عرفت chiasm البصرية (أوتش). وضع كمية صغيرة من قطع الأمثل (OCT) درجة الحرارة المتوسطة في كريومولدس منفصلة اثنين. ضع المخ (تحتوي على رابطة أمامي اللحاء (فرنسا) ونواة accumbens الأساسية (يعقب)) في الجانب الأمامي كريومولدس إلى أسفل. إضافة المتوسطة أكتوبر كافية لتغطية الأنسجة. كرر هذه الخطوة مع أنسجة المخ الذي يتضمن الحصين (Hp) ونواة suprachiasmatic (SCN). السماح بالمتوسط أكتوبر إلى تجميد تماما ل ~ 20 دقيقة في كريوستات. مرة واحدة بالانسجة والمتوسطة أكتوبر مجمدة تماما، الضغط على كمية صغيرة من أكتوبر على رأس متصاعدة واضغط كريومولدس المجمدة التي تحتوي على الأنسجة إلى رأس المتصاعدة. تسمح OCT لتجميد تماما حيث أن القالب الذي يحتوي على الأنسجة موصولة بشكل أمن إلى الرأس. تأمين المرفق الرئيسي لجبل تقطيع وتشديد المسمار. ضبط زاوية القطع فيما يتعلق بشفرة كريوستات مع دعامتين التكيف لضمان يتم قطع الفروع بالتساوي. تعيين سمك الباب 30 ميكرومتر. عند تقطيع كتلة الأنسجة التي تحتوي على تقييم الموارد الحرجية، ويعقب، تبدأ أولاً تمزيقها حتى قشرة الدماغ الظاهر وجمع ابدأ ثم- إشارة إلى 12 أطلس الدماغ الفئران، والفرع، والدماغ تجميع المقاطع بلطف وضع درجة حرارة الغرفة البولي إثيلين نابثالاتي (القلم) غشاء الشرائح على رأس الأنسجة مقطعة لتقييم الموارد الحرجية حتى القشرة الحركية الثانوية (M2 ) هو الذي تم التوصل إليه في 5.16 بريجما مم. بصريا ضمان التقيد بالشريحة بفحص حالة الأنسجة وأكتوبر هي ذابت تماما على شريحة. تخزين كافة الشرائح مع أقسام الأنسجة في كريوستات حتى تلطيخ. يواصل تمزيقها حتى يصبح مرئياً commissure الأمامي (aca) وتوحد في commissure كاملة واحدة أسفل البطينين الأفقي الظاهر الآن (LV) ملم 1.80 بريجما. تظهر المقاطع جمع حتى LVs للتواصل مع هيئة مكافحة الفساد في بريجما 0.84 مم- بمجرد تقطيع لتقييم الموارد الحرجية ويعقب قد اكتملت، إزالة كتلة الأنسجة المركبة، واستبدال مع كتلة تحتوي على HP والعقدة. الباب حتى أوتش هو تسطيح في بريجما مم-0.480، عندما تتضح البطين الثالث (3V). جمع أبواب للجنة الفرعية للتغذية من هذه النقطة حتى بريجما مم-0.720، عندما يبدأ ديكوساتيون سوبراوبتيك (sox)- ملاحظة: قد يكون ضروريا لجمع المزيد من المقاطع الأنسجة في جميع أنحاء أوتش حيث يتم تمرير العقدة بسهولة. لجمع HP، القسم حتى القرون الخلايا الحبيبية طبقة المغزلي المسنن (جردج) واضحة وضوحاً عند بريجما مم-3.000. جمع الفروع حتى تنصهر فيها الفروع كاليفورنيا هيبوكامبال في أقسام الاكليلية في بريجما مم-4.780. يسمح هذا التفصيل لمجموعة كاملة من الحصين تحت موقع اوديما وإصابة. ملاحظة: كما يتضح في المنشورات السابقة من هذا المعمل، الأكثر إصابة الخلايا ستكون واضحة داخل هذا النطاق وأنها مناسبة لتحليل التعبير الجيني أو ميكرورنا- 2. تلوين بروتوكول قبل أن يغسل المصبوغة، جميع أواني والمنطقة المصبوغة في غطاء الأبخرة كيميائية مع القضاء على رناسي المنظفات. إعداد هذا يخفف من خطر تدهور الجيش الملكي النيبالي بسبب التلوث- إعداد جميع الكواشف والحلول في نوكلاس المصبوغة المياه مجاناً- تأخذ رف من الشرائح المخزنة في كريوستات ومكان في غطاء الدخان. السماح للشرائح الحارة لمكان س. 30 منهم في تلطيخ الحلول (أعدت مع نوكلاس المياه مجاناً) على النحو التالي: 75% EtOH لمدة 1 دقيقة، نوكلاس مجاناً الماء لدقيقة 1، 1% كريسيل البنفسجي لمدة 1 دقيقة، نوكلاس المياه مجاناً لمدة 30 ثانية، نوكلاس المياه مجاناً لمدة 30 ق ، 95% EtOH لمدة 30 ثانية، 100% EtOH 30 ثانية وزيلين نفط لمدة 3 دقائق زيلين نفط للحد الأدنى 3 السماح بالرف أيردري للا يزيد عن 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان. بدلاً من ذلك، وضع رفوف في مجففة فراغ خالية من رناسي للتجفيف أسرع. مرة واحدة المجففة، الشروع فورا في LCM. 3. المناظير باستخدام الأشعة “أطلس تسترشد ليزر التقاط ميكروديسيكتيون” مع نظام LCM قبل البدء في أي إجراء LCM لتحليل الحمض النووي الريبي، يمسح أسفل منطقة جمع والمنطقة المحيطة بالجهاز مع القضاء على رناسي المنظفات و 100% EtOH. الوجه مفتاح الطاقة على وحدة توليد قبل تشغيل المجهر قاعدة ليزر الأشعة تحت الحمراء، والسماح للنظام بتهيئة قبل بدء تشغيل البرنامج من على سطح المكتب- ملاحظة: إذا لم ينجز في هذا الأمر، البرامج لن تعترف بالمجهر. مجرد تمهيد البرامج وتشغيلها من خلال الخطوات التي اتخذها أثناء تهيئة، اضغط " “المرحلة الحالية” " زر في البرنامج " لوحة الإعداد. " مرحلة وحدات سينتقل إلى موقع حيث يمكن تحميل LCM الماكرو قبعات والشرائح وتفريغها. وضع الشرائح غشاء القلم إلى أصحاب (ما يصل إلى ثلاثة في وقت واحد) مع حافة متجمد تواجه رايتوارد. ملاحظة: إذا وضعت في حامل في اتجاه خاطئ، البرنامج قد لا قادراً على التعرف بشكل صحيح منطقة قطع الأشعة تحت الحمراء أو الأشعة فوق البنفسجية المطلوب. انقر فوق " Mem " خانة الاختيار في " كاب ومجال التعامل مع الشريحة " بجوار الشريحة المعنية (أي، ألف أو باء أو جيم). تعني هذه الخطوة إذا كانت الشريحة شريحة زجاجية غشاء. ثم انقر فوق الشريحة المطلوبة لالتقاطها أولاً. حدد لجعل الكاميرا تأخذ صورة متجانبة لموقع الأنسجة والتوجه لكاب المواضع، " الصورة " على شريط الأدوات، حدد " الحصول على نظرة عامة حول. " ملاحظة: إذا كان المستخدم مألوف مع الأنسجة يجري جمعها، يمكن حذف هذه الخطوة باستخدام الكرة التمرير اليدوي للموقف " مركز المنطقة " لجمع. ضع المؤشر فوق منطقة الصورة المتجانبة (أو الموقع النسبي دون تجانب الصورة)، انقر بالزر الأيمن واختر " “كاب مكان” في مركز المنطقة. " البرنامج تلقائياً سيتم وضع سقف على المنصب المحدد. تحديد موقع- ملاحظة: لضمان أن ليزر الأشعة تحت الحمراء يتم محاذاتها بشكل صحيح، وسوف أتناول فقط المناطق التي تزرع فيها البقع بالبرنامج فإنه يجب أن يكون موجوداً قبل المتابعة. الانتقال إلى منطقة داخل عملية النداءات الموحدة التي توجد فيها لا الأنسجة. انقر فوق " أنا " في " “جزء أدوات ميكروديسيكت” " وحدد " تحديد موقع الأشعة تحت الحمراء " علامة التبويب. من الجزء، إطلاق النار النار لتقييم أين هو إطلاق النار ليزر الأشعة تحت الحمراء وحجم المكان اختبار الأشعة تحت الحمراء- مع المؤشر، انقر على الحق في منتصف الأشعة تحت الحمراء بقعة وحدد " تقع الأشعة تحت الحمراء بقعة. " ملاحظة: حجم وكثافة شعاع الأشعة تحت الحمراء يمكن تغيير بواسطة تغيير يدوياً " السلطة، القطر، أو مدة " تحت كل مصمم حجم البقعة، أو بالانتقال التدرجي في الجزء السفلي من مربع الحوار. قد تحتاج عدة طلقات اختبار لإطلاقها لضمان حجم بقعة مناسبة. ليزر الأشعة تحت الحمراء يجب أن تكون إعادة الموجود في كل مرة يتم تبديل موضع التغييرات كاب أو الشرائح. “للأشعة فوق البنفسجية” القطع، قم بتحديد موقع الليزر الأشعة فوق البنفسجية عن طريق تحديد " تحديد موقع الأشعة فوق البنفسجية " علامة التبويب في مربع الحوار. ملاحظة: نظراً لأن الليزر الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء ليزر تتحرك في انسجام، ليست هناك حاجة استمرار إعادة تحديد الليزر الأشعة فوق البنفسجية في كل مرة يتم تغيير الموقف- اختر " “الرسم اليدوي الحر” " الخيار في " “حدد جزء أدوات” ". استخدام إبرة الفونوغراف لمس، رسم حول محيط منطقة الفائدة في حين التأكد من عدم فقدان الاتصال بين رئيس القلم ولمس. تأكد من أن الاتصال ببداية واندبوينتس معا. ملاحظة: البقع الأشعة تحت الحمراء سوف توضع تلقائياً من خلال البرنامج ولكن قد يختار المستخدم لوضع نقاط إضافية كفالة التقيد الأنسجة إلى الحد الأقصى بعد تنفيذ قطع الأشعة فوق البنفسجية- جمع “لتقييم الموارد الحرجية”، وتنفيذ التقاط ليزر إجمالي من الأنسجة القشرية حتى عند ظهور القشرة M2 مم 5.16 بريجما. ملاحظة: هذا التفصيل يمكن تعديله أن أجزاء معينة فقط من فرنسا أو أنواع محددة من الخلايا التي يتم جمعها. مجموعة “ليعقب”، والتقاط الليزر بإغلاق منطقة بالقرب من هيئة مكافحة الفساد- الأساسية وشل من يعقب أداء وظائف مختلفة وفريدة من الناحية الفسيولوجية. وبالتالي من المهم تتبع أطلس الدماغ في أقرب وقت ممكن. من المستحسن أن تجمع من أي مكان آخر في الماضي بريجما 0.84 مم، وهما المناطق دون الإقليمية أصبحت أيضا مرتبطة ارتباطاً وثيقا ببعضها البعض. جمع “لحصان”، ليزر التقاط 1 CA، الفروع هيبوكامبال 2 و 3 ابتداء من الساعة 3.00 بريجما ملم واستخدام جردج تماما شكلت معلما مادية لتحديد الخصائص المورفولوجية. ملاحظة: لأغراض هذه الدراسة، لا تجمع في الماضي بريجما مم-4.780، الذي يمكن أن يتم ترسيمه بصريا كالنقطة عند الفروع Hp تنصهر فيها وأشر بطنيا. تم اختيار هذا المجال كما أصيب آخر يمكن اكتشاف الخلايا العصبية مباشرة تحت موقع الإصابة 6- لجمع العقدة، أولاً بصريا تحديد كثافة الأنوية التي تجلس الظهرية أوتش ومن ثم جمع. بعد مجموعة من المناطق (المذكورة أعلاه)، نقل قبعات الماكرو LCM " موضع مراقبة الجودة " وفحص للأنسجة كاملة الالتزام بضمان بصريا الأشعة فوق البنفسجية قطع الأنسجة متصل بالغشاء. بسرعة ضع أنطون كاب خالية رناسي 0.5 مل رد مسورة رقيقة أنبوب يحتوي على 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية. عينات دوامة بإيجاز لضمان تحلل كامل وتخزينها في-80 درجة مئوية. عند هذه النقطة، يمكن أن يكون مؤقتاً LCM وتخزين العينات حتى تستخدم لتحليل الجينوم المصب 6-

Representative Results

التخطيطي قدمت في الشكل 1 يوضح سير العمل عموما من أطلس تسترشد LCM لمناطق محددة من الدماغ وتطبيقات تحليل المتلقين المحتملين. ركزت هذه الدراسة على أربع مناطق الدماغ ذات الصلة إلى تبي الفيزيولوجيا المرضية وإلى تطوير comorbidities: تقييم الموارد الحرجية ويعقب والعقدة وحصان. حد موجودة في LCM لمناطق محددة من الدماغ أن المواقع التشريحية غالباً ما تحجب بالافتقار إلى حدود محددة، كما يتبين في الشكل 2 (ألف، د، ز، ي). استخدام أطلس الدماغ لتوجيه تمزيقها والاستيلاء على مناطق محددة بالليزر يقلل من احتمال تلوث العينة بالدماغ في مناطق أخرى بخلاف الهدف. التكنولوجيا LCM عندما هو الحرص على اتباع معالم الأنسجة، سواء أثناء تقطيع وبعد تلطيخ نيسل، يمكن أن توفر وسيلة متسقة عالية لحيازة السكان منفصلة من الخلايا، ونواة، أو المناطق15. الأهداف الطويلة الأجل لهذه الدراسات يتم تحديد الجينات وميكرورناس التي يمكن أن يحتمل أن تكون بمثابة بديل، المؤشرات الحيوية غير الغازية لإصابات الدماغ منطقة محددة. الخطوة الأولى في هذا الأنبوب وضع العلامات البيولوجية هو وصف التغييرات الخاصة بالانسجة النسخي بعد تبي التجريبية. يمكن ثم الربط بين هذه البيانات مع التغييرات الناجمة عن الإصابة بتعميم بيوفلويدس. الإجراءات المعروضة كانت الأمثل للتخفيف من خطر تدهور الجيش الملكي النيبالي من أجل السماح لتحليل الحمض النووي الريبي عن طريق النسخ العكسي لمجموع LCM الحمض النووي الريبي قبل الكمي PCR الوقت الحقيقي (RT-قبكر). مجموع الحمض النووي الريبي (بما في ذلك الأنواع رنا الصغيرة والكبيرة) كانت معزولة استخدام أسلوب عزل على أساس العمود على الأنسجة التي تم التقاطها الليزر من مناطق الدماغ الفردية. لتقييم سلامة الحمض النووي الريبي والنوعية والكمية وبعد إجراءات العزل، بإيجاز عينات الحمض النووي الريبي التشويه والتحريف في 70 درجة مئوية وتشغيلها على محلل الحمض النووي الريبي. وشملت القياسات النوعية تحليل ستريك الذروة للعصابات الرنا الريباسي 18s و 28s (الرقم 3)، التي يمكن أن تكون ممثلة تدهور الشامل، واستخدام “الحمض النووي الريبي سلامة عدد ” (رين). إذا كان استخدام تقنيات خالية رناسي حذراً، الحمض النووي الريبي المعزولة من عينات LCM عادة النتائج في رطبها التي تتراوح من 6-8. رين السفلي يمكن أن ينطوي على رداءة الجيش الملكي النيبالي ويحتمل أن إنقاص دقة تحليل التعبير الجيني وميكرورنا. على العكس من ذلك، يمكن تحسين رين أعلى الثقة في صحة النتائج التي تم إنشاؤها من تحليل الحمض النووي الريبي. RT-qPCR أجرى باستخدام مجموعات التحقيق التمهيدي/للجينات الفردية وميكرورناس (الشكل 4). حوالي الساعة 1 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي كان عكس نسخها إلى كدنا وتضخيم مسبقاً قبل أن أنجز قبكر وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. وشملت الجينات المتعلقة بالإصابة في هذه الدراسة تقييم X المرتبطة BCL2، منظم المبرمج (باكس)، 2 CLL/سرطان الغدد الليمفاوية الخلية-ب (Bcl-2)، 3 كاسباسي، أبوبتوسيسريلاتيد السيستين بيبتيداسي (Casp3) ، الدماغ المستمدة عامل نيوروتروفيك (Bdnf)، و معسكر عنصر استجابة ملزمة البروتين 1 (كريب). واختير مير-15b لأنه قد ثبت لتغييره بعد تبي التجريبية في الخلايا العصبية يموتون فرادى. أيضا تجريبيا صادق وتنبأ بيوينفورماتيكالي أهداف الجينات مع وظائف الموالية البقاء على قيد الحياة (بيانات غير منشورة). حسبت نسب التغيير حظيرة طبيعية بأسلوب ΔΔCt مقارنة مستويات التعبير الجيني وميكرورنا في الحيوانات تبي وضوابط السذاجة، مع تطبيع للجين الذاتية (جابده) أو رنا الصغيرة (U6)، على التوالي. تجليد-تغيير أعلاه 1 يشير إلى upregulation عموما في تلك الجينات أو ميكرورنا، وعلى العكس من ذلك، حظيرة تغيير أقل من 1 يشير إلى downregulation. التحليل الإحصائي أظهرت التغييرات الهامة في التعبير الجيني بين التحكم تبي والسذاجة (p ≤ 0.05) التي كانت منطقة الدماغ تعتمد. تم الكشف عن أي تغيرات هامة في التعبير مير-15b بين التحكم تبي والسذاجة، ولكن كانت هناك اتجاهات نحو التعبير العليا والسفلي بطريقة تعتمد منطقة الدماغ. هذه البيانات تشير إلى أن التحسين إضافية ضرورية لتقييم التغييرات في التعبير ميكرورنا. من الممكن أيضا كان حجم العينة صغيرة جداً للحصول على دلالة إحصائية، جزئيا بسبب تقلب المتأصلة في التعبير. الدراسات المستقبلية سوف تشمل الحيوانات تعمل بالشام لضمان ذلك الجين وتغييرات التعبير microRNA تنسب إلى تبي وليس بسبب إعداد العمليات الجراحية. رقم 1. سير العمل ليسترشد أطلس LCM لتحليل الجينوم المصب. (واو) الإجراءات من إعداد الحيوانات لتحليل qPCR المصب: (أ) الكبار، والذكور الفئران “سبراغ داولي” (~ 6 أسابيع من العمر ووزنها 300 غرام) يتم تخديره، تخضع لقرع السوائل تبي، وإنسانية euthanized 24 ساعة بعد الإصابة. (ب) الفروع المسلسل (30 ميكرومتر) من العقول المجمدة الطازجة يتم استناداً إلى إحداثيات مناطق محددة من الدماغ (فرنسا، يعقب، Hp، واللجنة الفرعية للتغذية) من أطلس “الدماغ الفئران” أوضح وواطسون. (ج) أقسام ثابتة، ملطخة بنسل (1% بنفسجي كريسيل)، والمجففة، وتجفف في الهواء. (د)-LCM يقوم على تحديد مناطق الدماغ مع نظام LCM. (ه) LCM الماكرو قبعات نقلها على أنبوب 0.5 مل رناسي مجاناً مع 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي الريبي لتحليل الجينوم المتلقين للمعلومات. الجيش الملكي النيبالي يمكن ثم نسخها من الاتجاه المعاكس لتحليل RT qPCR الجينات أو ميكرورنا لدراسة التعبير التفاضلية من الجزيئية الهدف (ق) بعد تبي و/أو بين مناطق الدماغ للفائدة (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2. LCM تبي تتأثر مناطق الدماغ. صور الممثل لأقسام الأنسجة التي تم جمعها من الجانب عن موقع الإصابة بالأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية بالليزر وظائف على نظام LCM (أ–أنا). الأنسجة مقطوع في كريوستات (30 ميكرومتر) والتي جمعت في الشرائح غشاء القلم. المقاطع ثم ثابتة، الملطخة نيسل مع كريسيل البنفسجي (1%)، ونزعت إلى تحديد مناطق المخ محددة استناداً إلى المعالم التشريحية المشار إليه في أوضح وواطسون “أطلس الدماغ الفئران”. (أ-ج) منطقة القشرة رابطة أمامي (FrA) (د-و) مكونات الطبقات الهرمية CA1 و CA2 CA3 من قرن آمون (Hp) الموجود بجوار قرون شكلت بالكامل من الطبقة الحبيبية من المغزلي المسنن (جردج). (ز–أنا) منطقة شركة accumbens نواةإعادة (يعقب) الدانية وروسترال إلى كوميسوري الأمامي (هيئة مكافحة الفساد). (ي-ك) سوبراتشياسماتيك نواة (SCN) روسترال تشياسم سوبراوبتيك (أوتش). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3. مسح ممثل من نوعية الجيش الملكي النيبالي- اليكتروفيروجرامس الممثل والصور المرتبطة بها جل من الحمض النووي الريبي المستمدة من LCM جمع الأنسجة (أ-د). اليكتروفيروجرامس والصور المرتبطة بها جل إظهار الجيش الملكي النيبالي سليمة استناداً إلى ظهور قمم الرنا الريباسي 18s و 28s وعصابات هلام. هذا الجيش الملكي النيبالي مناسبة لجميع التطبيقات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك الجينوم وتحليلات للبروتين. (أ) أمامي رابطة اللحاء (FrA) الجيش الملكي النيبالي. رين 6.1. (ب) الحصين (Hp) الجيش الملكي النيبالي. رين 4.4. (ج) accumbens النواة الأساسية للحمض النووي الريبي (يعقب). رين 7.3. (د) سوبراتشياسماتيك (SCN) نواة الجيش الملكي النيبالي. رين 7.6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4. تحليل المصب من الجينات الخاصة بكل منطقة الدماغ والتعبير MicroRNA عبر RT-قبكر- QPCR RT الفردية للجينات للفائدة (باكس، Bcl-2، بدنف، Casp3، كريب) وميكرورنا للفائدة (مير-15b) أنجز في مناطق الدماغ الليزر استولت بعد تبي (Hp ويعقب ن = 5، ن فرا = 4) ومقارنة بالحيوانات السذاجة يصب (n = 4). تم إجراء تحليل للجينات المتعلقة بمنشأ تبي لعرض Hp، يعقب، طراز FCx. البيانات كحظيرة طبيعية تغيير النسب مقارنة بمناطق الدماغ التحكم السذاجة (الاختبار t مزاوج مع تصحيح ± وولش SEM؛ * p ≤ 0.05) (A). ويرد التعبير التفاضلية من مير-15b في مناطق مختلفة من الدماغ كحظيرة طبيعية التغييرات مقارنة بالسذاجة التحكم (± SEM) (ب). بيانات من اللجنة الفرعية للتغذية (n = 2) غير المدرجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وأصبح LCM للدراسات الجزيئية للدماغ الثدييات، أسلوباً أساسيا. يوضح هذا المقال أن استخدام مزيج الليزر قطع الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية في النظام LCM يمكن التقاط التغييرات الجينية في أي منطقة من الدماغ الثدييات. وتشمل هذه المناطق تلك التي يمكن تحديدها بالبقع LCM المتوافقة التقليدية، مثل البنفسجي كريسيل أو الهيماتوكسيلين ويوزين. سرعة عملية التقاط الليزر والقدرة على أداء LCM على أقسام ميكرومتر 30 سمكا على الشرائح غشاء القلم يسمح ليس فقط الحصول على كميات كافية من عينات الخلية، ولكن أيضا لعزل الحمض النووي الريبي من عينات LCM من نوعية مناسبة لجميع أنواع المتلقين للمعلومات تحليل الجينوم؛ وتشمل هذه التحاليل [ميكروارس]¹⁶وبكر صفائف¹⁷والكمي PCR الوقت الحقيقي¹⁸.

البيانات المتوفرة لدينا تقديم أساس منطقي للدراسات التي تستخدم الأنسجة LCM. أننا نجد أن مير-15b upregulated في قرن آمون وقشرة (الشكل 4) ولكن دوونريجولاتيد في accumbens نواة وقد تكون ذات صلة بيولوجيا لفهم الآثار المتفاوتة تبي في الدماغ. واقترحت دراسة سابقة أن الزيادات في ضعف الخلايا العصبية القشرية للإصابة نتيجة overexpression من عدة ميرناس سلبا على تنظيم الجينات الموالية البقاء على قيد الحياة، مثل Bcl-2¹⁹. يبين التحليل تفحص الهدف Bcl-2 يخضع أيضا مير-15 باء؛ وهكذا، تشير البيانات المتوفرة لدينا تفسيراً آليا لماذا مناطق محددة من الدماغ (أي، طراز FCx) قد تكون عرضه بشكل انتقائي إلى تبي. من المهم أن نتذكر وينظم معظم الجينات ميرناس متعددة وربط التغيرات في أي ميرنا واحد لجينة محددة هدف ومن الصعب. وعلاوة على ذلك، تشير هذه البيانات إلى أن تغييرات معينة في التعبير الجيني وميكرورنا يمكن أن تستخدم كالمؤشرات الحيوية لتلف الدماغ الخاصة بالمنطقة. وفي الواقع، نحن حاليا تستخدم هذه البيانات في الدراسات من جديد كيف محصن خلطات يمكن أن تؤثر المخدرات المركبات ذات الخصائص المضادة للاكتئاب على التعبير الجيني وميكرورنا في مناطق الدماغ مرتبطة باضطرابات عصبية. واحد الحد من دراستنا هو أنه أثناء خطوات متعددة من عمليات إعداد الشرائح ل LCM، قد تصبح الشبهة سلامة الحمض النووي الريبي. ويصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة للتخفيف من مخاطر تدهور الجيش الملكي النيبالي. قيد آخر هو حجم العينة صغيرة نسبيا المستخدمة لحساب إحصائية. في المستقبل ينبغي أن يقلل من دراسات، وزيادة حجم العينة آثار التغيرات التعبير الجيني وميرنا بين الحيوانات الفردية.

هو تحقيق منفعة LCM في دراسات الجينوم متعدية باستخدام نماذج حيوانية للأمراض البشرية والأنسجة المريضة²⁰^،²¹^،^،من²²²³. دون القدرة على التقاط السكان خلية معينة، سيكون لمحات النسخي من مناطق الدماغ المختلفة مزيج مجهول ومستحيل من العديد من أنواع الخلايا. استخدام أساليب LCM في الدراسات إصابة المخ أدى إلى الجهود المبذولة حاليا لرسم المخ منطقة محددة المؤشرات الحيوية، وأن نفهم كيف أنها ترتبط بتعميم المؤشرات الحيوية تبي.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نعترف سومنر إليزابيث ليساعدها في تحرير هذه المخطوطة. التمويل اللازم لهذا المشروع قدمت في جزء “المشروع مودي” متعدية الجنسيات البحث إصابة الدماغ الصدمة و RO1NS052532 إلى هلة.

Materials

Arcturus Laser Capture Microdissection System	Applied Biosystems (Life Technologies)
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1513
Arcturus PEN Membrane Glass Slides	Applied Biosystems (Life Technologies)	LCM0522
Capsure LCM caps	Applied Biosystems (Life Technologies)	LCM0211/LCM0214
Cresyl Violet Acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
Xylene (Histological grade)	Fisher Scientific	X3P-1GAL
Ethanol 200 proof (Histological grade)	UTMB Pharmacy
RNAqueous Micro- Kit	Life Technologies (Ambion)	AM1931
Taqman Gene Expression Primer/Probes	Applied Biosystems (Life Technologies)	4331182
Taqman microRNA Expression Primer/Probes	Applied Biosystems (Life Technologies)	A25576
Lightcycler 96 System	Roche

Referanslar

Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
Mills, J. D., et al. Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe. PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).
Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future. J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).
Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).
Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
Rojo, D. R., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).
Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).
Shearer, J., et al. Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury. Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).
Caeyenberghs, K., et al. Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients. Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).
Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy. Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).
Karatsoreos, I. N. Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health. Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).
Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., Hörtnagl, H., Pitkänen, A., Sperk, G. Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury. Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).
Huusko, N., Pitkanen, A. Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI. Nörobilim. 267, 30-45 (2014).
Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2013).
Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).
Hellmich, H. L., et al. Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury. PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).
Boone, D. R., et al. Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury. PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).
Boone, D. R., et al. Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock. PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).
Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury. Brain Res. 1533, 122-130 (2013).
Hellmich, H. L., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer’s disease. Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).
Elstner, M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
Wang, S., et al. Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors. BMC.Genomics. 11, 163 (2010).

Etiketler

Stereotactic Atlas Laser Capture Microdissection Traumatic Brain Injury Frontal Cortex Hippocampus Molecular Analysis Transcriptional Analysis Cryostat Optimal Cutting Temperature Medium Brain Regions Cell Types

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Weisz, H. A., Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury. J. Vis. Exp. (127), e56134, doi:10.3791/56134 (2017).