Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Pawan Noel; Ruben Mu&#241;oz; George W. Rogers; Andrew Neilson; Daniel D. Von Hoff; Haiyong Han

doi:10.3791/56081

JoVE Journal > Cancer Research

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Kanser Araştırmaları

Preparación y análisis metabólico de 3 dimensiones del esferoide co-cultivos de células de cáncer de páncreas y fibroblastos

Published: August 23, 2017

doi:

10.3791/56081

Pawan Noel¹, Ruben Muñoz¹, George W. Rogers², Andrew Neilson², Daniel D. Von Hoff¹, Haiyong Han¹

¹Molecular Medicine Division,Translational Genomics Research Institute, ²Agilent Technologies

Özet

Aquí, se describe un método para la preparación de la cultura de co de 3 dimensiones (3D) esferoide de células de cáncer de páncreas y fibroblastos, seguidos por la medida de las funciones metabólicas utilizando un analizador de flujo extracelular.

Abstract

Muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer pancreático tienen un estroma fibroso denso que desempeña un papel importante en la progresión del tumor y la invasión. Los fibroblastos activados cáncer asociado son un componente clave del estroma tumoral que interactúan con las células cancerosas y apoyar su crecimiento y supervivencia. Modelos que recapitulan la interacción de las células cancerosas y activación los fibroblastos son herramientas importantes para el estudio de la biología stromal y para el desarrollo de agentes antitumorales. Aquí, se describe un método para la generación rápida de cultura Co robusto 3 dimensiones esferoide (3D) de las células de cáncer de páncreas y fibroblastos pancreáticos activados que pueden ser utilizados para posteriores estudios biológicos. Además, se describe es el uso de esferoides 3D para llevar a cabo análisis funcionales metabólicos para sondear los caminos de la bioenergética celular utilizando un analizador de flujo extracelular acompañado de una microplaca de esferoide. Las células del cáncer pancreático (Patu8902) y las células del fibroblasto pancreática activada (PS1) fueron cultivadas conjuntamente y magnetizan utilizando un conjunto de nanopartículas biocompatibles. Las células magnetizadas eran rápidamente bioprinted con unidades de disco magnéticos en un formato bien 96, en medios de crecimiento para generar esferoides con un diámetro que oscila entre 400-600 μm dentro de los 5-7 días de la cultura. Ensayos metabólicos funcionales con esferoides Patu8902 PS1 entonces se llevaron a cabo utilizando la tecnología de flujo extracelular para sondear vías energéticas celulares. El método aquí es simple, permite la generación consistente de cáncer co-cultivos de células fibroblasto esferoide y potencialmente adaptables a otros tipos de células de cáncer en la optimización de la actual metodología descrita.

Introduction

En la última década, se han desarrollado numerosos en vitro modelos 3D para recapitular e investigar las en vivo tumor biología, microambiente y crecimiento condiciones de cáncer células¹^,². Monocapa (2D) dos dimensiones de la célula cultura sistemas de exposición uniforme a factores bioquímicos y compuestos en fase de investigación no replicar las interacciones tumor stromal 3D nativas expuestas a un gradiente de difusión a través del medio extracelular de compuestos matriz de³^,de proteínas (ECM)⁴. Así, en comparación con modelos 2D cultivo de tejidos, cáncer 3D modelos han surgido para mejor Mostrar potencial simulando el microambiente del tumor y sirve como herramientas importantes para mejor entender en vivo características del tumor, tales como hipoxia, desmoplasia, latencia, penetración de la droga, toxicidad y resistencia terapéutica⁵^,⁶. Para ello, modelos 3D con potencial para reducir la brecha entre cultivos celulares 2D y modelos todo animales imitando en vivo características del tumor, mientras que relativamente barato y optimizado para la consistencia y la rápida generación. Estas ventajas están siendo explotadas para acelerar la investigación traslacional en muchas áreas, incluyendo Biología del cáncer, morfogénesis y⁷^,⁸de ingeniería de tejidos.

En un aumento de la evolución de métodos de cultivo de tejido 3D, técnicas de levitación magnética recientemente se han desarrollado y descrito para el crecimiento, valoración y proyección de imagen de esferoides derivaron de varias células tipos⁹^,¹⁰^, ¹¹ ^, ¹². bioprinting 3D magnético explota el uso de fuerzas magnéticas para los tejidos por células con nanopartículas biocompatibles de magnetización e imprimirlas en formatos múltiples bien. Esto permite la producción rápida de consistente, cerca de esferoides 3D idénticos, que pueden ser aprovechadas y empleadas para una amplia gama de aplicaciones posteriores para bioquímicas y biofísicas de la investigación¹⁰. Aquí hemos adaptado la técnica de la magnético bioprinting con un material biocompatible llamado Nanoshuttle (NS) compuesto de óxido de hierro, poli L-lisina y oro nano partículas para etiquetar los fibroblastos y las células de cáncer de páncreas. NS une electrostáticamente a la membrana plasmática, no se sabe que se unen a receptores específicos de cualquier, y lanzamientos fuera de la célula de la superficie dentro de una semana. Se requiere muy bajo fuerzas magnéticas (30pN), bastante árido pero no daño las células y no afecta la viabilidad celular, el metabolismo o proliferación hacer extremadamente biocompatible para culturas 3D¹⁰^,¹³^,¹⁴ ^,¹⁵.

En este estudio, con cáncer de páncreas como ejemplo y modelo, se describen la generación y análisis metabólico de esferoides celulares fibroblastos de cáncer 3D. A partir de células cultivadas en recipientes 2D, nos ilustran las condiciones de cultivo y crecimiento de esferoides de cocultivo de fibroblasto de tumor pancreático con bioprinting magnético. Esferoides cultivadas entonces fueron utilizados en los ensayos metabólicos funcionales utilizando un analizador de flujo extracelular, una tecnología demostró a medida simultáneamente las dos vías productoras de energía, glucólisis y la respiración mitocondrial, en una variedad de la vida células y tejidos¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Glicólisis se midieron como un cambio en la tasa de acidificación extracelular (ECAR), mientras que la respiración mitocondrial o fosforilación oxidativa se midió como la tasa de consumo de oxígeno (OCR). Proponemos que este método desarrollado por esferoides de tumor pancreático puede servir como columna vertebral para optimizar y traducir generación de esferoide 3D del tumor y análisis a otros tipos de células y tejidos.

Protocol

1. cultura de cáncer pancreático esferoides 3D usando magnético Bioprinting uso estándar aséptico tejido cultura técnica, las células de cultivos de interés en un matraz T75 a una confluencia de 70-80% de medios de cultivo apropiados. Nota: Normalmente, 5-7 × 10 6 células un 70-80% confluente T75 frasco fueron cosechadas. Dos diferentes tipos de células se utilizaron en este estudio – Patu8902 (células del tumor pancreático) y PS1 células (células radiadas pancreática activada 21). Ambas líneas celulares fueron cultivadas en medios del Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) suplementado con 10% (v/v) serum(FBS) bovino fetal, 1 × penicilina-estreptomicina (p/s). Lavar las células una vez con 5 mL de Dulbecco ' tamponada de fosfato s saline(DPBS). Separar celdas de plástico de la superficie por trypsinizing con 2 mL de 0.05% tripsina-EDTA durante 5-10 min a 37 ° C. Revise para separación de células bajo un microscopio. Desactivar tripsina por la adición de medios de cultivo de 8 mL para extraer células. Evitar sobre tripsinización, como esto puede afectar negativamente la salud/viabilidad de células de. Las células de la pipeta hacia arriba y hacia abajo para generar una suspensión unicelular y recuento celular densidad utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Mientras tanto, equilibrar un frasco de NS a temperatura ambiente. Calcular la cantidad de células necesarias para sembrar el número deseado de esferoides (pozos) y alícuota a un nuevo tubo cónico de 15 mL. Por ejemplo, a las semillas un 96 todo bien la placa con 5.000 células/pozo, células de 5 alícuota mínimo 5,5 × 10. Colectar las células por centrifugación a 500 x g durante 3 min con cuidado aspiración o decantar el sobrenadante y resuspender las células a una concentración de 1.0 x 10 6 células/mL en medios de crecimiento. Pipeta con una punta de la pipeta amplia aburrido para evitar el corte. Por ejemplo, resuspender 5.5 x 10 5 células en 550 μl de medio de crecimiento. Magnetizar la cantidad deseada de las células mediante el equilibrado NS (criterio 1.6). Directamente añadir NS a la suspensión de células en medios de cultivo y agitar suavemente. Para el eficiente etiquetado magnético de las células, use 10 μl NS por 100 células μl (suspendidas en 1 x 10 6 células/mL). Nota: Para un experimento típico, etiqueta 5.5 × 10 5 Patu8902 células en 550 μl con 55 μl NS y 1.1 × 10 6 PS1 en 1100 μl, (por separado) con 110 μl NS. Suavemente invertir tubo unas cuantas veces para asegurar la suspensión de la célula. Temporalmente, transfiera la mezcla células-NS en un único pozo de una placa de 24 pocillos. Hacerlo por separado para cada tipo de célula al ser magnetizado. Cubrir la placa e incubar las células a temperatura ambiente durante 2 h con agitación suave para permitir la Unión de NS a superficie de la célula. Nota: Cultura y ensayo de esferoides a partir ya sea de Patu8902 o PS1 solo las células, además de esferoides de cocultivo a partir de dos células de tipos premezclados antes de impresión en discos magnéticos fue alcanzada con éxito usando este método en independiente experimentos. Un método para la generación de esferoides de cocultivo de células Patu8902 y PS2 se describe a continuación en los pasos siguientes. Pipeta arriba y abajo de las células magnetizadas suavemente para mezclar homogéneamente y preparar una mezcla principal que contiene el número deseado de la célula. Para la siembra de esferoides, utiliza un total de 15.000 células (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) y ajustar a un volumen total de 150 μL por pocillo de una placa de 96 pozos. Nota: El volumen final suministrado en cada pozo debe ser el mismo independientemente del número de células utilizadas. Colocar una placa de 96 pocillos celular repelente en la cima de la unidad de esferoide magnético de 96 pocillos y dispensar 150 μL de la mezcla de células en cada pozo. Observar las células recoge lentamente al centro del pozo sobre el imán. Cubra e incube la placa durante la noche en una 5% CO 2 incubadora conjunto a 37 ° C con la unidad de esferoide magnético todavía conectada. Retire la unidad magnética e incubar de crecimiento durante 7 días. Nota: Es fundamental utilizar las placas del crecimiento celular repelente para la impresión del esferoide con esferoide magnético unidades. Asegurar que la unidad del esferoide con imanes más pequeños más finos se utiliza, no la unidad de explotación. Vigilar el crecimiento de esferoides cada día. Reponer con medios de cultivo frescos cada tres días mediante la colocación de la placa de crecimiento montada en el magnético manteniendo la pieza en un ángulo y utilizando una pipeta multicanal para dibujar hacia fuera gastado media. Nota: Las células Patu8902 y PS1 Co sembradas en 15.000 células/pozo crecerá en 3D esferoides con un diámetro de 400-600 μm dentro de los 5-7 días. En este momento están listos para caracterización metabólica, evaluación de medicamentos y otras aplicaciones posteriores esferoides. 2. Análisis metabólico de esferoides de Tumor pancreático 3D para caminos de la bioenergética utilizando el analizador de flujo extracelular Nota: en esta sección, el análisis de las funciones metabólicas de los esferoides mediante un flujo extracelular Analizador de microplacas de ensayo diseñado específicamente para 3D esferoides se describe. Lavado y traslado de esferoides de las placas de crecimiento al esferoide ensayo microplacas. Nota: Esferoides pueden utilizarse para ensayos metabólicos cuando alcanzan un diámetro de ~ 500 μm. El día antes de realizar el análisis, hidratar el cartucho de sonda o sensor con ensayo calibrant (200 μL/pocillo) de la placa de utilidad suministrado e incubar durante la noche (4-18 h) en una incubadora humidificada (no-CO 2) a 37 ° C. Preparar el medio de ensayo apropiado para el ensayo metabólico deseado complementando los medios base (véase la tabla de materiales) o ensayo de 2 mM L-glutamina para prueba de esfuerzo de glucólisis (GST) o con piruvato de 1 mM, 2 mM L-glutamina y 10 mM glucosa para un ensayo de prueba de estrés mitocondrial (MST). Nota: El analizador de flujo extracelular mide la respiración mitocondrial (OCR) y glucólisis (ECAR) de células vivas en un formato de placa de 96 pocillos. Estas proporciones ofrecen una visión general de la función metabólica celular en muestras de bajo investigación. Por favor consulte el manual de los kits de ensayo para obtener instrucciones detalladas. Después de agregar análisis específicos suplementos (ver paso 2.1.1), caliente el medio suplementado de ensayo en un baño de agua de 37 ° C y ajustar el pH a 7,4 ± 0.1 con 0.1N NaOH. Mantener el medio caliente hasta uso. Ensayo de reconstituir los reactivos del kit en el medio de ensayo calibrado a concentraciones stock recomendados. Nota: Estos se realizan en 10 × la concentración final deseada en los pozos. Concentraciones de valores para la glucosa, oligomycin y 2-deoxi-glucosa (2-DG) son 100, 100 μm y 500 mM, respectivamente. Observar esferoides en la placa de crecimiento bajo una luz microscopio para comprobar para morfología esferoide y uniformidad general; en cuanto a la forma y el structure de los esferoides. Transferencia de la placa de crecimiento en un disco magnético de sujeción y cuidadosamente aspirar el medio de crecimiento de ~ 120 μl. Suavemente Lave esferoides con ~ 120 μl de medios de ensayo calentado y previamente calibrado, Aspire y repetir el lavado dos veces. Inspeccione los esferoides bajo el microscopio para asegurarse de que los esferoides no se lavan lejos. Preparar la esferoide ensayo microplaca mediante la adición de medios de ensayo caliente de 180 μl a cada pocillo. Establecer una micropipeta de P20 a 10 μl y coloque un extremo ancho aburrido a él. Si no hay consejos de ancho aburridos, corte las puntas de pipetas regular con tijeras limpias o bisturí para ensanchar el agujero. Nota: Esto debe reducir la esquila y preservar la morfología general de los esferoides se transfiere a las placas de ensayo. Utilice una superficie caliente (37 ° C) para llevar a cabo transferencia de esferoides. Utilice una superficie de visor de película de radiografía calentada con una lámpara de luz blanca para mejorar contraste y visualización de esferoides durante el proceso de transferencia de ayuda. Cuidadosamente aspirado un sola esferoide pre-lavado de la placa de crecimiento celular repelente utilizando una micropipeta P20 equipado con una amplia diámetro punta y ligeramente esferoide de transferencia directamente en el centro de cada pocillo de una placa de ensayo de esferoide para llevar a cabo el metabolismo ensayo. Permitir que cada esferoide caer suavemente en la cámara de micro central de cada pozo por pura gravedad para rellenar la placa de ensayo. Nota: Tarda generalmente 5-8 s para cada esferoide caer en el centro del pozo por gravedad. No extraiga la pipeta hasta que los esferoides han asentado en la cámara de micro. No depósito esferoides en los pozos 4 esquina de la placa de ensayo (A1, A12, H1, H12) puesto que éstos se utilizará como pozos fondo. Vigilar la morfología y la posición de cada esferoide para asegurar que cada esferoide es en el centro de cada pozo. Si es necesario, vuelva a colocar al centro del pozo aspirando a esferoide usando una amplia diámetro punta de la pipeta y la subsecuente deposición por gravedad. Una vez que se han transferido los esferoides, coloque la placa de ensayo en una incubadora de aire humidificado de 37 ° C (no-CO 2) para que una hora antes del análisis. Cargar cartucho de sensor con compuestos y realizar el análisis Prepare 10 × concentración reactivos específicos de ensayo en los medios específicos de ensayo descritos en el paso 2.1.2. Por ejemplo, realizar GST, reconstituir glucosa, oligomycin y 2-DG en volúmenes recomendados a que se refiere el manual de ensayo. Realizaron ensayos de GST y MST con esferoides de PS1 Patu8902. Correctamente orientar el cartucho de sensor con filas etiquetadas A-H en el lado izquierdo y colocar a una guía de carga en la parte superior del cartucho de sensor. Asegurar la correcta carga de puerto deseado por orientación de la guía de carga para que la letra correspondiente al puerto a cargar está en la esquina superior izquierda. Usando una pipeta multicanal, pipetear reactivos directamente en puertos de inyección. Mantener carga guías en posición usando las yemas de los dedos durante todo el procedimiento. Nota: Cada reactivo se inyectará en un puerto recomendado en el manual de análisis. Evitar la creación de burbujas de aire pero no golpee cualquier pieza del cartucho para quitar burbujas de aire. Quitar carga guía y posición a nivel de ojo con cartucho visualmente puertos de inyección para cargar incluso. Crear el protocolo de diseño instrumentos de ensayo experimental utilizando el controlador de instrumento software de onda (en adelante, software de análisis) como se describe en la sección 2.3. Análisis diseño y ejecución mediante el software de análisis crear una plantilla de análisis para el experimento de Abra el software de análisis y haga clic en " plantillas " o elegir entre un análisis existente plantilla. Haga doble clic en " plantilla en blanco de ". Definir los grupos experimentales y condiciones. Estrategias de inyección definir puertos A, B y C. dejar vacío de puerto D. Nota: Para análisis de GST, solo estos puertos cargarán con glucosa, Oligomycin y 2-DG. En caso de ensayo de MST, se cargarán oligomycin, FCCP y rotenona. Definir tratamientos previos si esferoides fueron tratados con uno o más compuestos de la prueba y el grupo de control. Definir los medios de análisis para incluir fuente, suplementos y otra información. Definir uno o más tipo de la célula (e.g. Patu8902, PS1) ver la información de densidad y pasaje número. Haga clic en " generar grupos de ". Haga clic en " placa mapa " ficha y asignar grupos a la placa de ensayo correspondiente al diseño experimental. Seleccione los pozos de cuatro esquinas como pozos de fondo. Asegúrese de que no hay esferoides en estos pozos. Ejecutar el análisis en el analizador haga clic en la ficha protocolo instrumento mantenga el valor predeterminado comandos protocolo marcando " calibre ", " equilibrar " y " ciclo de medición de referencia ". Clic " las inyecciones " y definir para cada puerto. Editar ciclos de medida a 6 ciclos de la falta los 3 ciclos de esferoides. Mantener la mezcla de 3 minutos por defecto, 0 min de espera y los tiempos de medida de 3 min. Nota: Tiempos de mezcla espera de medida por defecto son 3 minutos, 0 min, 3 min, respectivamente. Tres mediciones de la tasa basal normalmente se toman antes de la inyección del primer ensayo compuesto. Estas mediciones pueden ser calibradas y reajustadas según el diseño experimental. Revisar protocolo y resumen grupo. Guardar la plantilla de diseño análisis. Proceder a la calibración de pre-ensayo una vez puertos de inyección han sido cargados con sustratos de ensayo. Transferir el cartucho con la placa de utilidad para el analizador de flujo extracelular. Nota: Esto generalmente completa dentro de 15-20 min y calibra los sensores para realizar mediciones de OCR y ECAR. Después de la calibración del cartucho, vuelva a colocar la placa de utilidad con la placa de ensayo precalentado que contiene esferoides 3D e iniciar el ensayo. Después de que se hayan completado las mediciones, exportar los datos a la hoja de cálculo o software estadístico y gráfica para analizar los datos.

Representative Results

El flujo de trabajo general para bioprinting magnética y el análisis de flujo extracelular de esferoides 3D La figura 1 muestra un resumen de todo el proceso descrito en el presente Protocolo. Las células del cáncer pancreático (Patu8902) y activado las células radiadas (PS1) fueron cultivadas en frascos de cultivo de tejidos que contienen medios de cultivo apropiados a una confluencia de 70-80%. Las células fueron separadas de la nave de cultura 2D y lavaron, densidad celular se determinó y las células finalmente se resuspendió en medios de crecimiento en el 1 × 106 células/mL. NS, un conjunto de nanopartículas de oro, óxido de hierro y poly-L-lisina fue utilizada para magnetizar las células. Células Patu8902 y PS1 individualmente magnetizadas luego se mezclaron e impresas en placas de 96 pocillos crecimiento celular repelente montadas en una unidad de esferoide magnético. Hemos optimizado los 15.000 para ser el número total de células para la siembra de un solo pozo (5.000 células de Patu8902 mezclados con células de PS1 10.000 para generar un único esferoide). Después de la incubación en condiciones adecuadas de cultivo de tejidos durante 5-7 días, se obtuvieron esferoides 3-dimensional, tiempo durante el cual el crecimiento de estos esferoides fue monitoreado y registrado. Después de lavar con los medios de ensayo, esferoides fueron transferidos físicamente en una microplaca de esferoide para llevar a cabo ensayos metabólicos usando un analizador de flujo extracelular para la medición simultánea de la glucólisis y la respiración mitocondrial. Cultura y el crecimiento de esferoides de fibroblasto de tumor pancreáticoPara obtener esferoides funcionales y robustas, la célula de cáncer epitelial línea Patu8902 y células radiadas PS1 fueron cultivadas en RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal. Células de PS1 magnetizadas con el NS y Pat8902 fueron luego mezcladas en una proporción de 1:2, para un total de 15.000 células por pocillo en una placa de crecimiento de la semilla. Dentro de las 24 h de impresión las células en los discos magnéticos, células focalizadas al centro del pozo exactamente en la parte superior de cada perno magnético en cada pocillo. Crecimiento de esferoides Patu8902 PS1 fue monitoreado por la proyección de imagen en los días 2, 4, 7 y 9 después de la siembra de las células. La figura 2 muestra la cuantificación del diámetro promedio de esferoides representante en varios puntos del tiempo anteriores. Aumenta el diámetro de esferoides de μm 414 día 2 596 μm en el día 7 post impresión. No hubo diferencias significativas entre el crecimiento en los días 7 y 9, y así todos más experimentación fue limitada a 7 días de crecimiento del esferoide. Notamos que los esferoides adquieren una morfología más especialmente alrededor de los bordes y el NS progresivamente se difunde más uniformemente en todo el volumen del esferoide con más días en la cultura. También se estimó la esfericidad de 10 esferoides basado en la longitud de sus ejes mayores y menores. La esfericidad media es 0,92 ± 0.04 para Patu8902 solo (tumor), 0,95 ± 0.04 para PS1 (estroma) solo y 0.94 ± 0.02 de esferoides de co-cultivo. Análisis funcional metabólico de pancreáticos esferoides 3D usando el analizador de flujo extracelularPara probar la funcionalidad de los esferoides, empleamos metabólico y el análisis de bioenergética para sondear los caminos de la energía en esferoides. Llevamos a cabo una prueba de esfuerzo de glicolisis en esferoides cultivadas como se describió anteriormente. Con este fin, esferoides generados a partir de células Patu8902 o PS1 además de las resultantes de una cultura de cooperación de los dos tipos celulares fueron sometidos a análisis. Curiosamente, los tres tipos de esferoides, si origina de células distintas o mixtas, exhibieron una respuesta biológicamente funcional para el ensayo de GST. Al inyectarse una concentración de saturación de la glucosa, los tipos de esferoides probaron Mostrar aumentos en el camino glicolítico según lo evidenciado por un aumento de ECAR (figura 3). Cuando, producción de ATP mitocondrial se inhibió usando oligomycin, producción de energía cambia a glucólisis y empuja las células a máxima capacidad glicolítica, vista como aumento en ECAR. Inhibición de la glucólisis con la 2-DG, un análogo de glucosa que competitivo se une la glucosa hexoquinasa, resultado en una disminución de ECAR, confirmando que el aumento previo de ECAR era debido a la actividad glicolítica. Nos dimos cuenta de que los esferoides probados en este estudio respondieron de esta manera, aunque las PS1 solo esferoides (diámetro promedio 250 μm) tenían una señal relativamente baja, posiblemente debido a su menor tamaño y menor capacidad glicolítica en comparación con el cáncer de Patu8902 células (diámetro promedio 600 μm). En general, una mayor ECAR señal de tumor celular basada en células esferoides en comparación con los de relativamente pequeño fibroblasto de PS1 deriva esferoides, posiblemente podría atribuirse a inclinación metabólico inherente de las células cancerosas hacia glucólisis22, 23. Los tres tipos de esferoides fueron derivados de la siembra el mismo número de células, aunque notamos que la variación del tamaño de esferoide entre cada tipo, con PS1 solo esferoides es más pequeño, seguido por esferoides de co-cultivo, y esferoides solo Patu8902 el más grande. Para probar la función mitocondrial en esferoides 3D, objeto de esferoides de cocultivo a un ensayo de MST. El MST mide parámetros claves de la función mitocondrial por medición directa de OCR de células (figura 4A y 4B). Una inyección de serie con compuestos (oligomycin FCCP y una mezcla de rotenona y antimycin A) fue utilizada para medir parámetros mitocondriales clave tales como, producción, máxima respiración y respiración no mitocondrial de ATP. Estos parámetros y tasas de respiración basal más se utilizaron para calcular la pérdida de protón y capacidad respiratoria (figura 4). Una disminución de OCR en respuesta a oligomycin, un inhibidor de la ATP sintasa (complejo V) se corresponde con la respiración mitocondrial, asociada con la producción de ATP celular. Esferoides se incubaron con oligomycin para una duración más larga permitir la máxima penetración y tiempo de respuesta eficiente. Una segunda inyección con uncoupler FCCP estimula el consumo máximo de oxígeno y un aumento correspondiente en OCR. El OCR FCCP-estimulado se utilizó para calcular la capacidad respiratoria, una medida de la capacidad de la célula para responder a la demanda creciente de energía. La tercera inyección; una mezcla de rotenona, (un complejo inhibidor) y la antimicina A (un inhibidor del complejo III) bloquea la respiración mitocondrial, vista como una disminución aguda de OCR (figura 4BONG >). En general, nuestras observaciones confirman la funcionalidad de esferoides cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular como una medida de su espacio/actividad metabólica tanto en términos del potencial glicolítico y mitocondrial como se describió anteriormente. Figura 1 . Representación esquemática de la metodología para la cultura y el análisis de esferoides de cáncer pancreático células/fibroblasto. Patu8902 y PS1cells fueron cultivados, tripsinizaron, lavado y contado. Para la siembra cada esferoide, Patu8902 (5.000 células/pocillo) y fibroblastos (10.000 células/pocillo) de PS1 fueron magnetizados con NS e impresa en una placa de crecimiento celular repelente el día 1. Después de la siembra, la placa de crecimiento fue montada en una unidad de esferoide magnético (con un imán en cada pocillo de la placa de crecimiento 96 formato bien) y permitió a la cultura durante 2-7 días para obtener 3D esferoides. Los esferoides resultantes lavadas y transfiere a las placas de ensayo esferoide para llevar a cabo los ensayos metabólicos en el instrumento de flujo extracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 . Crecimiento de esferoides de tumor pancreático-fibroblasto. (A) una imagen representativa de PS1 Patu8902 esferoide de la cultura correspondiente al día en la cultura se muestra en la parte superior y el tamaño de diámetro del esferoide (μm) se cuantifica por debajo. Aumento progresivo de tamaño del esferoide y la difusión de partículas NS (puntos oscuros) en todo su volumen es evidente entre los días 2 y 7. Esferoides se mantuvieron en la cultura adicional 2 días después de esto, que no produjo un aumento significativo en el diámetro del esferoide. (B) representación de esferoides derivados de las células tumorales (Patu8902), células del estroma (PS1) y células cultivadas conjuntamente (Patu8902 + PS1) aparecerá. Datos de esfericidad (C) se representan de 10 esferoides individuales de cada grupo. Barras de error representan la desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 . Prueba de tensión de glucólisis (GST) con esferoides pancreáticos. (A) representación esquema de un ensayo típico glucolisis función con varios parámetros de análisis representadas. (B) un ejemplo de una prueba GST realizada en los esferoides páncreas cultivadas utilizando la metodología descrita. Rampas de inyección de glucosa por glucólisis, visto como un aumento de ECAR, con aumento en la adición de oligomycin apague la respiración mitocondrial. ECAR cae en respuesta a la 2-DG, un competitivo análogo de la glucosa, bloqueando la glicólisis. Esferoides todos se observan que exhiben una respuesta funcional para el ensayo de GST. (C) una salida de la prueba de GST con generador de informe del fabricante que representan los tres parámetros principales del ensayo GST. Barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Prueba de estrés mitocondrial (MST) con esferoides de PS1 Patu8902. (A) representación esquema de un análisis de la función mitocondrial típico con varios parámetros de análisis se representa. (B) se muestra un ejemplo del MST en los esferoides de fibroblasto de tumor pancreático. Esferoides 3D (C) Co cultura exhiben una respuesta funcional para el ensayo de MST. Como era de esperar, la función mitocondrial medida como una disminución de OCR fue notada cuando esferoides se desafiaron con oligomycin, un inhibidor de la sintasa de ATP. Utilizando FCCP a rampa a flujo del electrón dio lugar a la OCR máxima, que inmediatamente se derrumbó sobre la inhibición de la respiración mitocondrial utilizando un – cocktail de inhibidores de complejo mitocondriales. Barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Con cáncer pancreático, la 3^rd principal causa de cáncer de las muertes relacionadas con en los Estados Unidos²⁴, como ejemplo y modelo, un método rápido y consistente fue desarrollado para crecer y análisis 3D esferoides mediante el cocultivo de células de cáncer de páncreas y activa los fibroblastos pancreáticos. Usando el bioprinting magnético, se obtuvieron esferoides que varían en tamaño desde 400 a 600 μm de diámetro. Estos fueron sometidos a ensayos metabólicos para probar con éxito la funcionalidad de los esferoides 3D cultivadas. Este método es simple, coherente y fácilmente adaptables a otros tipos celulares.

Mientras que esta metodología será acelerar y añadir el valor traslacional de los ensayos realizados con esferoides 3D, puede mejorarse mediante el desarrollo de técnicas que permiten la multiplexación de la manipulación del esferoide y manejo. Esto debería reducir el tiempo total, costos y mano de obra necesaria para llevar a cabo el ensayo. Además, pueden utilizarse volúmenes de esferoide para normalizar las señales OCR según lo informado por otros⁶. Volumen de esferoide normalizado por el volumen promedio de una célula podría utilizarse para determinar OCR por célula, pero ya crecimiento de esferoides no será idéntico, podría ser difícil calcular un OCR absoluta por la célula. Actualmente, esta metodología está limitada por la falta de una eficaz herramienta para multiplex esferoide manejo y transferencia de las placas de crecimiento entorno de ensayo.

El método descrito es modificado y adaptado de la tecnología de la bioprinting magnética y más validado para mostrar la relevancia funcional mediante la aplicación de los esferoides cultivadas a un análisis metabólico aguas abajo. El método proporciona una herramienta importante para generar esferoides sólidos, viables y funcionales que contienen los dos tipos de células grandes encontrados en la mayoría de los tejidos del tumor, las células cancerosas y fibroblastos cáncer asociado, que pueden ser empleados para otros ensayos de investigación, tales como pantallas de la droga. La relativa facilidad y la eficiencia de la metodología de NS es una mejora importante sobre otros métodos²⁵, tales como el colgante gota método²^,²⁶ de generación del esferoide.

Esferoides sólidos generados como tal son un modelo en vitro tumor que incluye células del estroma, que a menudo están ausentes en muchos estudios de cultura 3D. Son enormes las posibilidades de aplicación de modelos 3D esferoide generado como tal. Por ejemplo, estos modelos pueden emplearse para investigar las interacciones célula-célula, bioenergética cambios y prueba de susceptibilidad genética y dependencia de diferentes regímenes terapéuticos. Esferoides 3D que recapitulan el microambiente tumoral de en vivo sirven como herramienta altamente relevante y útil para los estudios y aquellos investigando los mecanismos de acción de la terapéutica actual y novedosa de detección de drogas. Análisis metabólicos de sondeo vías de energía utilizando esferoides culturas con las células mutantes pueden ayudar a arrojar nueva luz sobre el papel de los genes y rutas relacionadas en la Patobiología en un modelo 3D correspondiente de cáncer, como los esferoides se describe en este estudio.

La aplicación exitosa de este método se basa sobre todo en la salud de las células necesarias para la impresión magnética, razón por la cual células en fase logarítmica de crecimiento deben ser cosechado y magnetizado. Es fundamental utilizar el disco de esferoide magnético para imprimir células magnetizadas y no la unidad de explotación, que debe ser utilizada solamente durante el lavado del esferoide y medios de comunicación que pasos del método descrito. El otro aspecto más crítico para la lectura exitosa de análisis metabólicos es mantener la morfología de los esferoides durante el proceso de transferencia de la placa de crecimiento en la placa de ensayo.

En general, este protocolo se ha establecido para la generación de 3D esferoides que contienen células stromal, tras el ensayo metabólico posterior de los esferoides utilizando el analizador de flujo extracelular y cáncer. Las características clave de este método son que es rápido, fácilmente adaptable y consistente, relevante e imita el microambiente tumoral de en vivo , es relativamente barato y puede servir como una nueva herramienta para estudiar la biología del tumor y desarrollo contra el cáncer agentes.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Samuel Zirbel por ayuda en la optimización de las condiciones de cultivo y monitoreo crecimiento esferoide. Estamos agradecidos a las tecnologías de Agilent proporcionan SeaHorse XF analizador^e96, reactivos de análisis y conocimientos técnicos. También agradecemos a Dr. Hemant Kocher en Barts Cancer Institute de Estados Unidos para proveer las células de PS1. Este trabajo fue financiado en parte por la Seena Magowitz Fundación para la investigación del cáncer pancreático y un soporte hasta cáncer UK-Lustgarten Fundación pancreático cáncer sueño equipo investigación beca de investigación (número de subvención: SU2C-AACR-DT-20-16). Soporte hasta cáncer es un programa de la Fundación de la industria del entretenimiento. Becas de investigación son administrados por la American Association for Cancer Research, el socio científico de SU2C.

Materials

0.05% Trypsin EDTA	Sigma	25300-054
96 well cell repellant plate	USA Scientific/ Griener Bio-One	655970	spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
D-Glucose	Sigma	D9434
DPBS	Gibco	14190-144
Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
L-Glutamine	Sigma	59202C
Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent Technologies	103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C
Patu8902 cells	Laboratory Stock		pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells	Laboratory Stock		activated pancreatic stellate cells
RPMI1640	Gibco	11875-093	growth media for cells, spheroids
SeaHorse XF^e96 extracellular flux analyzer	Agilent Technologies		extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636
XF Base media	Agilent Technologies	102365-100	base media for metabolic assays on XF^e96

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3D Spheroid Co-culture Pancreatic Cancer Cells Fibroblasts Metabolic Assay Extracellular Flux Analysis Tumor Microenvironment Cell Magnetization Nanoshuttle Magnetic Spheroid Drive

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Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).