여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.
췌 장의 암 등 많은 암 종류, 조밀한 거리 기질 종양 진행에 침공 한 중요 한 역할을 했습니다. 활성화 된 암 관련 된 섬유 아 세포 종양 기질 암 세포와 상호 작용 하 고 그들의 성장 및 생존 지원의 핵심 구성 요소입니다. 암 세포의 상호 작용을 정리 하 고 섬유 아 세포를 활성화 하는 모델은 stromal 생물학을 공부 하 고 antitumor 에이전트의 개발을 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 췌장암 세포와 활성화 된 췌 장 fibroblasts 이후의 생물학 연구를 위해 사용할 수 있는 강력한 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 급속 한 세대에 대 한 메서드를 설명 합니다. 또한, 설명 이다 세포 생체 경로 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 프로브를 기능 대사 분석 수행에 3D spheroids의 사용와 결합 회전 타원 체 미 판. 췌 장의 암 세포 (Patu8902)와 활성화 된 췌 장 섬유 세포 (PS1) 공동 경작 했다 생체 나노 어셈블리를 사용 하 여 자기. 자성된 셀 bioprinted spheroids 문화의 5-7 일 이내 400-600 µ m 사이 직경을 가진 생성 하 성장 매체에서 96 잘 형식에서 마그네틱 드라이브를 사용 하 여 빠르게 했다. Patu8902-PS1 spheroids를 사용 하 여 기능 대사 분석 실험 다음 세포 에너지 경로 조사 하는 세포 외 유출 기술을 사용 하 여 실행 되었다. 방법은 여기 간단, 암 세포 섬유 회전 타원 체 공동 문화의 일관 된 세대 수 이며 잠재적으로 다른 암 세포 유형 현재 기술된 방법론의 최적화에 따라 적용할 수 있습니다.
지난 10 년간에서 수많은 생체 외에서 3D 모델 정리 하는 비보에 종양 생물학, microenvironment 및 성장 조건 암 세포1,2의 조사 개발 되었습니다. 2 차원 (2D) 단층 세포 생화학 요소와 조사 가능한 화합물에 균일 한 노출 시스템 실패는 extracellular 통해 확산 하는 화합물의 그라데이션 노출 네이티브 3D stromal 종양 상호 복제 하 문화 매트릭스 단백질 (ECM)3,4. 따라서, 2D 조직 문화 모델에 비해 3D 암 모델 잠재적인 종양 microenvironment 시뮬레이션에 더 나은 표시를 등장 하 고 중요 한 도구를 역임 vivo에서 종양 특성, hypoxia, 등 이해 desmoplasia, 휴면, 마약 penetrance, 독성 및 치료 저항5,6. 이 위해 3D 모델 빠른 생성 및 일관성에 대 한 상대적으로 저렴 하 고 최적화 하면서 종양 기능 vivo에서 을 흉내 낸에 의해 2 차원 세포 배양 및 전체 동물 모델 사이의 격차를 해소 하는 가능성이 있다. 이러한 장점은 암 생물학, morphogenesis와 조직7,8공학 등 많은 분야에서 번역 상 연구를 가속 화 하기 위해 악용 되 고 있습니다.
서 진화 하는 3 차원 조직 배양 방법을의 지, 자기 부상 기술을 최근 개발 되었고 성장에 대 한 설명, 다양 한 세포 유형9,10, 에서 파생 된 시 금 및 spheroids의 이미징 11 , 12. 자기 3D bioprinting 이용 생체 나노 입자를 세포 자화 및 멀티 잘 포맷에서 그들을 인쇄 하 여 조직 하 자기 세력의 사용. 일관성, 무력화 하 고 생화학 및 생물 조사10다운스트림 응용 프로그램의 과다에 대 한 고용 수 있는 동일한 3D spheroids 근처의 급속 한 생산 수 있습니다. 여기 우리는 산화 철, 폴 리 L-리 신 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포를 금 나노 입자의 구성 이라고 Nanoshuttle (NS) 생체 재료를 사용 하 여 자석 bioprinting 기술을 적응 했습니다. 원형질 막에 정전 NS 부착은 어떤 특정 한 수용 체, 바인딩할 알려져 있지 하 고 셀에서 출시 1 주일 이내 표면. 그것은 매우 낮은 자기 세력 (30pN) 필요, 충분히 집계 하지만 하지 해 세포와 세포 생존 능력, 신진 대사 또는 3D 문화10,13,14 매우 생체 수 있도록 확산에 영향을 미치지 않습니다. ,15.
이 연구에서는 생성 및 3D 암 세포 섬유 아 세포 spheroids의 대사 분석 결과 설명 예제 및 모델, 췌장암을 사용 하 여. 2D 선박에 경작 하는 세포에서 시작, 우리 자석 bioprinting를 사용 하 여 췌 장 종양-섬유 공동 문화 spheroids의 문화 및 성장 조건을 보여 줍니다. 교양된 spheroids는 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기능 대사 분석 실험에 사용 했다, 두 개의 주요 에너지 생산 경로, 분해 및 다양 한 라이브에서 미토 콘 드리 아 호흡 동시에 측정 하는 기술 시연 세포와 조직16,17,18,,1920. 분해 측정 했다 extracellular 산성화 속도 (ECAR) 변경으로 미토 콘 드리 아 호흡 또는 산화 인 산화 측정 되었다 하는 동안 산소 소비 속도 (OCR)으로. 우리는 췌 장 종양 spheroids에 대 한 개발이 방법 최적화 및 3D 종양 회전 타원 체 세대와 다른 세포/조직 유형 분석 결과 번역 백본으로 사용할 수 있습니다 제안 합니다.
췌장암, 3층 을 사용 하 여 주요 원인이 암 관련 사망자24, 예제와 모델, 신속 하 고 일관 된 방법으로 개발 되었다 성장 하 고 췌장암 세포의 공동 문화를 사용 하 여 3D spheroids 분석 결과 미국에서와 췌 장 섬유 아 세포 활성화. 마그네틱 bioprinting를 사용 하 여, 직경에 있는 400-600 µ m에서 크기에서 배열 하는 spheroids 획득 했다. 이러한 대사 분석 교양된 3D spheroids의 기능을 성공적으로 테스트를 받게 했다. 이 방법은 간단 하 고 일관 된 이며 다른 세포 유형에 쉽게 적응 시킬 수 있다.
동안이 방법을 가속화 되며 3D spheroids를 사용 하 여 수행 하는 분석 실험의 변환 값에 추가, 회전 타원 체 조작의 멀티플렉싱 및 처리 기술을 개발 하 여 향상 될 수 있습니다. 이 전체 시간, 비용 및 분석 결과 수행 하는 데 필요한 노동 감소 추가 해야 합니다. 또한, 정상화 OCR 신호6다른 사람에 의해 보고 하 회전 타원 체 볼륨을 사용할 수 있습니다. 회전 타원 체 볼륨 셀의 평균 볼륨 정규화 셀 당 OCR을 결정 하기 위해 사용 될 수 있지만 계산 셀 당 절대 OCR을 도전 수 있습니다 spheroids의 성장 같지 않을 것 이다, 이후. 현재,이 방법론은 환경 시험에 성장 격판덮개에서 다중 회전 타원 체 처리 및 전송에 효율적인 도구의 부족에 의해 제한 됩니다.
설명 하는 방법은 수정 하 고 자석 bioprinting 기술에서 적응 이며 더 교양된 spheroids 다운스트림 대사 분석 결과 적용 하 여 기능적 관련성을 표시 확인. 메서드는 대부분 종양 조직, 암 세포 및 다른 조사 가능한 분석 실험을 위해 채택 될 수 있다, 암 관련 된 섬유 아 세포에 있는 두 개의 주요 셀 형식을 포함 하는 강력 하 고, 가능한 고 기능 spheroids을 생성 하는 중요 한 도구를 제공 합니다. 같은 약물 스크린. 상대적 용이성 및 NS 방법론의 효율성 같은 교수형 드롭 방법2,26 회전 타원 체 세대의25의 다른 방법을 통해 주요 개선 이다.
이와 같이 생성 하는 강력한 spheroids는 생체 외에서 종양 모델 stromal 세포, 종종 많은 3D 문화 연구에서 포함 된 제공 합니다. 이와 같이 생성 된 3D 회전 타원 체 모델의 응용 프로그램에 대 한 가능성은 광대 한. 예를 들어 같은 모델 세포 세포 상호 작용, 생체 변화를 조사 하 고 유전적 민감성과 다양 한 치료 regimens의 테스트를 사용할 수 있습니다. Vivo에서 종양 microenvironment 정리 3D spheroids 마약 검사 연구와 현재 및 새로운 치료제의 행동의 메커니즘을 조사 하 고 그에 대 한 매우 적절 하 고 유용한 도구 역할을 합니다. 에너지 경로 spheroids 돌연변이 세포 문화 그 유전자 및 암, 관련 3D 모델에서 pathobiology에 관련 된 통로의 역할에 새로운 빛을 발산 도움이 될 수를 사용 하 여 프로 빙 대사 분석이이 연구에서 설명 하는 spheroids 같은.
이 방법의 성공적인 응용 프로그램 제일 이유 로그 단계에서 성장 하는 세포를 수확 해야 하며 자기는 자기 인쇄에 필요한 세포의 건강에 의존 합니다. 그것은 자석 회전 타원 체 드라이브를 사용 하 여 인쇄 자성 전지와 하지 지주 드라이브, 회전 타원 체 세척 및 미디어 보충 설명된 방법의 단계 중에 활용 해야 하는 중요. 변화 분석 실험의 성공적인 판독에 대 한 다른 가장 중요 한 측면은 시험 접시에 성장 격판덮개에서 전송 과정은 spheroids의 형태를 유지 하는 것입니다.
전반적으로,이 프로토콜 암, stromal 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 spheroids의 후속 대사 분석 결과 다음을 포함 하는 3D spheroids의 생성을 위해 설립 되었습니다. 이 방법의 주요 특징은은 빠르고, 쉽게 적응 하 고 일관 된, 관련 그리고 vivo에서 종양 microenvironment 모방, 비교적 저렴을 항 암 종양 생물학을 공부 하 고 개발 하기 위한 새로운 도구로 제공할 수 있다 요원입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 문화 조건 최적화 및 회전 타원 체 성장 모니터링에 사무엘 Zirbel에 게 감사 하 고 싶습니다. 우리는 해 마 XFe96 분석기, 분석 시 약 및 기술 통찰력을 제공 하기 위한 Agilent 기술에 감사입니다. 우리 또한 감사 박사 Hemant Kocher 바트 암 연구소 영국에서 제공 하는 PS1 셀. 이 작품 지원 부분에서 Seena Magowitz 재단에 의해 췌 장 암 연구와 서 최대 암-암 연구 영국 루스 재단 췌 장 암 드림 팀 연구 부여 (부여 번호: SU2C-AACR-DT-20-16). 암 최대 스탠드 엔터테인먼트 산업 재단의 프로그램입니다. 연구 보조금은 암 연구, SU2C의 과학적인 파트너를 위한 미국 협회에 의해 관리 됩니다.
0.05% Trypsin EDTA | Sigma | 25300-054 | |
96 well cell repellant plate | USA Scientific/ Griener Bio-One | 655970 | spheroid growth plate |
Cellometry Cell counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
D-Glucose | Sigma | D9434 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
L-Glutamine | Sigma | 59202C | |
Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103015-100 | |
n3D Magnetic Spheroid drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
n3D Magnetic Spheroid holding drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
n3D NanoShuttle-PL | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C |
Patu8902 cells | Laboratory Stock | pancreatic ductal adenocarcinoma cells | |
PS1 cells | Laboratory Stock | activated pancreatic stellate cells | |
RPMI1640 | Gibco | 11875-093 | growth media for cells, spheroids |
SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer | Agilent Technologies | extracellular flux analyzer | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
XF Base media | Agilent Technologies | 102365-100 | base media for metabolic assays on XFe96 |