Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Pawan Noel; Ruben Mu&#241;oz; George W. Rogers; Andrew Neilson; Daniel D. Von Hoff; Haiyong Han

doi:10.3791/56081

JoVE Journal > Cancer Research

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Kanser Araştırmaları

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Published: August 23, 2017

doi:

10.3791/56081

Pawan Noel¹, Ruben Muñoz¹, George W. Rogers², Andrew Neilson², Daniel D. Von Hoff¹, Haiyong Han¹

¹Molecular Medicine Division,Translational Genomics Research Institute, ²Agilent Technologies

Özet

Hier wird ein Verfahren zur Herstellung von 3-dimensionalen (3D) Sphäroid Kokultur Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten, gefolgt von Messung von Stoffwechselfunktionen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer beschrieben.

Abstract

Viele Krebsarten, einschließlich Krebs, haben eine Dichte fibrotische Stroma, die eine wichtige in der Tumorprogression und Invasion Rolle. Aktivierte Krebs Fibroblasten sind ein wesentlicher Bestandteil der Tumor-Stroma, die interagieren mit Krebszellen und unterstützt deren Wachstum und überleben. Modelle, die das Zusammenspiel von Krebszellen zu rekapitulieren und aktiviert die Fibroblasten sind wichtige Werkzeuge für die stromale Biologie zu studieren und für die Entwicklung von Antitumormittel. Hier wird eine Methode beschrieben, für die schnelle Erzeugung von robusten 3-dimensionale (3D) Sphäroid Kokultur pankreatischen Krebszellen und aktivierten Pankreas Fibroblasten, die für die nachfolgende biologische Untersuchungen verwendet werden können. Darüber hinaus beschrieb der Einsatz von 3D Sphäroide bei der Durchführung von funktionalen metabolische Assays, zellulären Bioenergetik Wege mit einer extrazellulären Flux-Analyzer Sonde ein Sphäroid Mikrotestplatte paart sich mit. Pankreatischen Krebszellen (Patu8902) und aktivierte Pankreas Fibroblastenzellen (PS1) wurden gemeinsam kultiviert und magnetisiert mit einer biokompatiblen Nanopartikel-Assembly. Magnetisierte Zellen waren schnell Bioprinted mit Magnetantrieben in eine 96-well-Format im Wachstumsmedium Sphäroide mit einem Durchmesser zwischen 400-600 µm innerhalb von 5-7 Tagen Kultur zu generieren. Funktionale metabolischen Tests mit Patu8902-PS1 Sphäroide wurden dann mit Hilfe der extrazellulären Flux Technologie, zelluläre Energiebahnen Sonde durchgeführt. Die Methode hierin ist einfach, ermöglicht die konsequente Generation von Krebs Zelle-Fibroblasten Sphäroid Ko-Kulturen und an anderen Krebsarten Zelle bei der Optimierung der gegenwärtigen beschriebenen Methode möglicherweise angepasst werden kann.

Introduction

In den letzten zehn Jahren wurden zahlreiche in-vitro- 3D Modelle zu rekapitulieren und zu untersuchen, die in Vivo Tumor Biologie, Mikroumgebung und Wachstum Bedingungen von Krebs Zellen¹^,²entwickelt. Zweidimensionale (2D) Monoschicht Zellkultur Systeme mit einheitlichen biochemische Faktoren und Prüfpräparate Verbindungen nicht die native 3D Tumor-Stromazellen Wechselwirkungen ausgesetzt auf einer Steigung von Verbindungen durch die extrazelluläre diffundierenden replizieren Matrix Proteine (ECM)³^,⁴. So, im Vergleich zu 2D Gewebekultur Modelle, 3D Krebs Modelle aufgetaucht, um besser zu simulieren den Tumor Mikroumgebung zeigen und diente als wichtige Werkzeuge zum besseren verstehen in Vivo Tumor Merkmale, wie z. B. Hypoxie, Desmoplasia, Dormanz, Medikament Penetranz, Toxizität und therapeutischen Widerstand⁵^,⁶. Zu diesem Zweck können 3D-Modelle der Brückenschlag zwischen 2D Zellkultur und ganze Tiermodellen durch die Nachahmung von in Vivo Tumor Merkmale, wobei relativ preiswert und optimiert für schnelle Erzeugung und Konsistenz. Diese Vorteile werden genutzt um die translationalen Forschung in vielen Bereichen einschließlich der Krebsbiologie, Morphogenese und Gewebetechnik⁷^,⁸zu beschleunigen.

In einer Woge der sich entwickelnden 3D Gewebekultur Methoden Magnetschwebebahn Techniken wurden vor kurzem entwickelt und beschrieben für Wachstum, prüfen und imaging der Sphäroide abgeleitet von verschiedenen Zelle Arten⁹^,¹⁰^, ¹¹ ^, ¹². Magnetic 3D Bioprinting nutzt die Verwendung von magnetischen Kräfte, Gewebe zu entwickeln, durch Magnetisierung Zellen mit biokompatiblen Nanopartikel und in mehreren gut Formaten ausdrucken. Dies ermöglicht schnelle Herstellung von konsequent, in der Nähe von identischen 3D Sphäroide, die genutzt werden können und für eine Vielzahl von downstream-Anwendungen für biochemische und biophysikalische Untersuchung¹⁰eingesetzt. Hier haben wir die magnetische Bioprinting-Technik mit einem biokompatiblen Material, die sogenannte Nanoshuttle (NS), bestehend aus Eisenoxid, Poly-L-Lysin und gold Nanopartikeln zu bezeichnen Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten angepasst. NS wird elektrostatisch an der Plasmamembran, ist nicht bekannt, an keine bestimmten Rezeptoren binden und Veröffentlichungen aus der Zelle Oberfläche innerhalb einer Woche. Es erfordert sehr geringe magnetische Kräfte (30pN), genug, um Aggregat aber nicht Schaden Zellen und hat keinen Einfluss auf die Zellviabilität, Stoffwechsel oder Verbreitung machen es äußerst biokompatibel für 3D Kulturen¹⁰^,¹³^,¹⁴ ^,¹⁵.

In dieser Studie beschreiben mit Bauchspeicheldrüsenkrebs als Vorbild und Modell, wir die Erzeugung und metabolische Assay 3D Krebs Zelle-Fibroblasten Sphäroide. Ausgehend von Zellen in 2D Gefäßen kultiviert, zeigen wir die Kultur und das Wachstum Bedingungen der pankreatischen Tumor-Fibroblasten Kokultur Sphäroide mit magnetischen Bioprinting. Kultivierte Sphäroide wurden dann in funktionale metabolischen Tests mit einer extrazellulären Flux-Analyzer verwendet, eine Technologie demonstrierte gleichzeitig messen der zwei wichtigen Energiebahnen produzierenden, Glykolyse und mitochondriale Atmung, in einer Vielzahl von live Zellen und Gewebe¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Glykolyse wurde gemessen, wie eine Veränderung in die extrazelluläre Übersäuerung Rate (ECAR), mitochondriale Atmung oder Oxidative Phosphorylierung wurde als Sauerstoff-Verbrauch (OCR). Wir schlagen vor, dass diese Methode für Pankreas-Tumor Sphäroide entwickelt als Backbone für die Optimierung und übersetzen 3D Tumor Sphäroid Generation und Assay auf andere Zelle/Gewebe dienen kann.

Protocol

1. Kultur des pankreatischen Krebses 3D Sphäroide mit magnetischen Bioprinting Using standard aseptischen Gewebekultur Technik, Zellkulturen von Interesse in einem T75 Kolben um eine Konfluenz von 70-80 % im entsprechenden Wachstumsmedium. Hinweis: In der Regel 5-7 × 10 6 Zellen aus einem 70-80 % konfluierende T75 Kolben geerntet wurden. Zwei verschiedene Zelltypen wurden in dieser Studie – Patu8902 verwendet (Pankreas-Tumor-Zellen) und PS1 Zellen (aktivierte Zellen der Bauchspeicheldrüse stellate 21). Beide Zelllinien wurden kultiviert in Roswell Park Memorial Institute Medien 1640 (RPMI-1640) ergänzt mit 10 % (V/V) fetalen bovine serum(FBS), 1 × Penicillin-Streptomycin (p/s). Waschen Zellen einmal mit 5 mL Dulbecco ' s Phosphat gepufferte saline(DPBS). Detach Zellen aus Kunststoff Oberfläche durch trypsinizing mit 0,05 % 2 mL Trypsin-EDTA für 5-10 min bei 37 ° c-Check für die Ablösung der Zelle unter dem Mikroskop. Deaktivieren Trypsin durch Zugabe von 8 mL Wachstumsmedien, freistehende Zellen. Über Trypsinization, zu vermeiden, da dies negativ auf die Gesundheit/Lebensfähigkeit der Zellen auswirken kann. Pipettieren Zellen auf und ab, einen einzigen Zellsuspension und Graf generieren Zelle Dichte mit einem automatisierten Zelle Zähler oder ein Hemocytometer. In der Zwischenzeit ein Fläschchen mit NS auf Umgebungstemperatur equilibrate. Berechnen die Höhe der Zellen für die Aussaat der gewünschten Anzahl der Sphäroide (Brunnen) und Aliquot zu einem neuen 15 mL konische Schlauch benötigt. Z. B. auf Saatgut eine ganze 96 gut mit 5.000 Zellen/gut, aliquoten mindestens 5,5 × 10 5 Zellen Platte. Sammeln Zellen durch Zentrifugieren bei 500 X g für 3 min. sorgfältig Aspirieren oder Dekantieren des Überstandes und die Zellen in einer Konzentration von 1,0 x 10 6 Zellen/mL in Wachstumsmedien Aufschwemmen. Pipette vorsichtig mit einer breiten gelangweilt Pipettieren Spitze Scheren zu vermeiden. Z. B. Aufschwemmen 5.5 x 10 5 Zellen in 550 µl Wachstumsmedium. Magnetisieren die gewünschte Menge an Zellen mittels äquilibriert NS (Schritt 1.6). Direkt die Zellsuspension in Wachstumsmedien NS hinzufügen und vorsichtig schütteln. Verwenden Sie für die effiziente magnetische Kennzeichnung von Zellen, 10 µL NS pro 100 µL Zellen (Nukleinsäuretablette 1 x 10 6 Zellen/ml). Hinweis: Für ein typisches Experiment Label 5,5 × 10 5 Patu8902 Zellen in 550 µL mit 55 µL NS und 1,1 × 10 6 PS1 Zellen in 1100 µL (separat erhältlich) mit 110 µL NS. Sanft Invert Rohr ein paar Mal um Zellsuspension zu gewährleisten. Vorübergehend, übertragen Sie die Zelle-NS-Mischung in einen einzigen Brunnen von einer 24-Well-Platte. Tun Sie dies separat für jeden Zelltyp magnetisiert werden. Abdeckplatte und inkubieren Sie Zellen bei Raumtemperatur für 2 h mit sanft schütteln um NS-Bindung an die Zelloberfläche ermöglichen. Hinweis: Kultur und Assay Sphäroide beginnend entweder aus Patu8902 oder PS1 allein Zellen zusätzlich Kokultur Sphäroide beginnend mit beide Zelltypen Komplettformel bevor bedrucken Magnetantriebe erfolgreich erreicht wurde diese Methode in unabhängigen Experimente. Eine Methode zur Erzeugung von Kokulturen Sphäroide aus Patu8902 und PS2 Zellen in den nachfolgenden Schritten beschrieben ist. Pipettieren nach oben und unten die magnetisierten Zellen sanft, gleichmäßig mischen und bereiten Sie einen master-Mix mit der gewünschten Zelle Nummer. Für die Aussaat Sphäroide, insgesamt 15.000 Zellen (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) verwenden und anpassen auf ein Gesamtvolumen von 150 µL pro Bohrloch einer 96-Well-Platte. Hinweis: Das Endvolumen verzichtet in jedem Bohrloch muss unabhängig von der Anzahl der verwendeten Zellen gleich sein. Legen Sie eine Zelle abweisende 96-Well-Platte auf der 96-Well magnetische Sphäroid Antrieb und 150 µL Zelle-Mix in jede Vertiefung zu verzichten. Die Zellen langsam sammeln in die Mitte des gut über den Magneten zu beobachten. Decken Sie und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem 5 % CO 2 Inkubator gesetzt bei 37 ° C mit dem magnetischen Sphäroid Laufwerk noch befestigt. Entfernen der Magnetantrieb und inkubieren Sie für weiteres Wachstum für bis zu 7 Tage. Hinweis: Es ist entscheidend für die Zelle abweisend Wachstumsfugen Sphäroid mit magnetischen Sphäroid Laufwerke verwenden. Sicherzustellen, dass der Sphäroid-Laufwerk mit dünner kleiner Magnete verwendet wird, nicht das Laufwerk halten. Überwacht das Wachstum der Sphäroide jeden Tag. Auffüllen mit frischem Wachstumsmedien alle drei Tage durch die Platzierung der Wachstumsfuge montiert auf die magnetische Laufwerk schräg halten und mit einem Mehrkanal-Pipettieren verbrauchte Medien zeichnen. Hinweis: Patu8902 und PS1 Zellen ausgesät Co an 15.000 Zellen/Brunnen in 3D Sphäroide mit einem Durchmesser von 400-600 µm innerhalb von 5-7 Tagen wachsen. An dieser Stelle Sphäroide sind bereit für metabolische Charakterisierung, Drug Evaluation und anderen nachgelagerten Anwendungen. 2. Metabolische Assay von 3D pankreatischen Tumor Sphäroide für Bioenergetik Bahnen mit der extrazellulären Flux-Analyzer Hinweis: In diesem Abschnitt, die Analyse der metabolischen Funktionen die Sphäroide mit einer extrazellulären Flussmittel Analysator mit Assay Mikroplatten, die speziell für 3D Sphäroide beschrieben. Waschen und Übertragung der Sphäroide von Wachstumsfugen auf Sphäroid Mikroplatten assay. Hinweis: Sphäroide können für metabolische Assays verwendet werden, wenn sie einen Durchmesser von ca. 500 µm erreichen. Am Tag vor der Durchführung der Assay-Hydrat die Fühler oder Sensor Kartusche mit Assay Kalibrator (200 µL/Well) in der zur Verfügung gestellten Dienstprogramm Platte und inkubieren Sie Übernachtung (4-18 h) in einem befeuchteten Inkubator (-CO 2) legen Sie bei 37 ° c Bereiten die entsprechenden Assay-Medium für die gewünschten metabolischen Assay durch Ergänzung der Basis Media (siehe die Tabelle Materialien) mit entweder 2 mM L-Glutamin für Glykolyse Stresstest (GST) Assay oder mit 1 mM Pyruvat, 2 mM L-Glutamin und 10 mM Glukose für eine mitochondrialer Stress-Test (MST) Assay. Hinweis: Die extrazelluläre Flux-Analysator misst mitochondriale Atmung (OCR) und Glykolyse (ECAR) von lebenden Zellen in einem 96-Well-Platte-Format. Diese Sätze geben einen Überblick über die zellulären Stoffwechselfunktionen in Proben untersucht. Bitte lesen Sie das Handbuch in den Test-Kits für detaillierte Anweisungen. Nach dem Hinzufügen von assay spezifische Ergänzungen (siehe Schritt 2.1.1), ergänzt Assay Medium in einem 37 ° C Wasserbad warm und passen Sie den pH-Wert 7,4 ± 0,1 mit 0.1N NaOH. Das Medium warm halten, bis zur Verwendung. Stellen assay Kit Reagenzien kalibrierten Assay Mittel-und empfohlenen Aktien Konzentrationen. Hinweis: Diese werden bei 10 × die Endkonzentration gewünscht in den Vertiefungen gebildet. Lager Konzentrationen für Glukose, Oligomycin und 2-Deoxy-Glucose (2-DG) sind jeweils 100 mM, 100 µM und 500 mM. Beobachten Sphäroide in der Wachstumsfuge unter einem Licht Mikroskop für Sphäroid Morphologie und allgemeine Homogenität; in Bezug auf die Form und Struktur zu überprüfene die Sphäroide. Der Wachstumsfuge auf einen magnetischen Holding-Stick übertragen und sorgfältig Aspirieren ~ 120 µL Wachstumsmedium. Vorsichtig waschen Sie Sphäroide mit ~ 120 µL erwärmt und vorkalibriert Assay Medien, aspirieren Sie und wiederholen Sie das Waschen zweimal. Überprüfen Sie die Sphäroide unter dem Mikroskop erneut, um sicherzustellen, dass Sphäroide nicht weggespült werden. Bereiten den Sphäroid Assay Mikrotestplatte durch Hinzufügen von 180 µL warm Assay Medien in jede Vertiefung. 10 µL einer Mikropipette P20 gesetzt und einen breite gelangweilten Tipp darauf passen. Wenn große Langeweile Tipps nicht verfügbar sind, abgeschnitten die Spitzen der regelmäßigen Pipettenspitzen mit einer sauberen Schere oder Skalpell um die Bohrung zu erweitern. Hinweis: Sollte dies verringern, Scheren und bewahren die allgemeine Morphologie der Sphäroide bei der Übertragung um Platten assay. Verwenden Sie eine Oberfläche Warm (37 ° C), Übertragung der Sphäroide durchzuführen. Verwenden Sie eine x-ray Film Betrachter Oberfläche erwärmt mit einem Weißlicht-Lampe Kontrast verbessern und Visualisierung der Sphäroide während des Übertragungsprozesses zu unterstützen. Bohrung sorgfältig Aspirat, ein einzelnes vorgewaschen Sphäroid aus der Zelle abweisend Wachstumsfuge mit einer Mikropipette P20 mit einer breiten ausgestattet Spitze und sanft Transfer Sphäroid direkt in der Mitte von jedem Bohrloch ein Sphäroid-Assay-Platte für die Durchführung der metabolischen Assay. Ermöglichen jedem Sphäroid sanft in die zentrale Mikro-Kammer von jedem Bohrloch durch reine Schwerkraft zum Auffüllen der Assay-Platte fallen. Hinweis: Es dauert in der Regel 5-8 s für jede Sphäroid in der Mitte des Brunnens durch Schwerkraft fallen. Ziehen Sie nicht die Pipette bis die Sphäroide in der Mikro-Kammer niedergelassen haben. Tun nicht Einzahlung Sphäroide in den 4 Ecken Vertiefungen der Assay-Platte (A1, A12, H1, H12) da diese als Hintergrund Brunnen verwendet werden. Überwachen die Morphologie und die Position der jedes Sphäroid um sicherzustellen, dass jeder Sphäroid in der Mitte jedes gut ist. Bei Bedarf Reposition in die Mitte des Brunnens durch Absaugen, Sphäroid mit einem breiten Bohrung Pipettieren Tipp und anschließende Abscheidung durch die Schwerkraft. Sobald alle Sphäroide übertragen wurden, platzieren Sie die Test-Platte in einem 37 ° C befeuchtete Luft Inkubator (-CO 2) für eine Stunde vor dem Test. Laden Sensorkassette mit Verbindungen und Durchführung des Tests Vorbereitung 10 × konzentriert Assay bestimmte Reagenzien in den Assay bestimmte Medien im Schritt 2.1.2 beschrieben. Beispielsweise im Sinne GST durchführen, rekonstruieren, Glukose, Oligomycin und 2-DG in empfohlenen Mengen an der Assay-Handbuch. GST und MST-Assays wurden mit Patu8902-PS1 Sphäroide durchgeführt. Richtig ausrichten der Sensorkassette mit Zeilen, die mit der Bezeichnung A-H auf der linken Seite und legen Sie eine laden-Anleitung auf der Oberseite der Sensorkassette. Korrekte Verladung des gewünschten Anschlusses durch ausrichten den Laden-Guide so, dass der Buchstabe entspricht den Port geladen werden in der oberen linken Ecke zu gewährleisten. Mit einer Mehrkanal-Pipette Reagenzien direkt in Injektion Häfen zu verzichten. Halten Sie laden Guides in Position mit den Fingerspitzen während des Verfahrens. Hinweis: Jedes Reagenz wird in einem empfohlenen Hafen in dem Assay-Handbuch genannten injiziert werden. Vermeiden Sie Luftblasen, sondern tippen Sie nicht auf jedem Teil der Patrone um Luftblasen zu entfernen. Entfernen, laden Reiseführer und Position auf Augenhöhe mit Patrone Injektion Ports für gleichmäßige Belastung Sichtprüfung. Erstellen der experimentellen Assay Gestaltungsinstrument/Protokoll mit dem Instrument Controller Wave Software (von nun an Analyse-Software), wie in Abschnitt 2.3 beschrieben. Assay-Planung und Ausführung mit der Analysesoftware Erstellen einer Test-Vorlage für das Experiment Öffnen Sie die Analysesoftware und klicken Sie auf " Vorlagen " oder wählen Sie aus einer vorhandenen Assay Vorlage. Klicken Sie doppelt auf " leere Vorlage ". Definieren Versuchsgruppen und Bedingungen. Injektion definieren Strategien für Ports A, B und C. Urlaub Port D leer. Hinweis: Für GST-Assay, werden nur diese Ports mit Glukose, Oligomycin und 2-DG geladen werden. Im Falle von MST-Assay, Oligomycin, FCCP und Rotenon geladen. Definieren Vorbehandlungen wenn Sphäroide mit einem oder mehreren Testverbindungen und der Kontrollgruppe behandelt wurden. Definieren der Assay-Medien zur Quelle, Ergänzungen und andere Informationen enthalten. Definieren Sie mindestens eine Zelle (z. B. Patu8902, PS1) sehen die Dichte und Passage Informationen. Klicken Sie " erzeugen Gruppen ". Klicken Sie " Platte Karte " Registerkarte, und weisen Sie Gruppen an der Assay-Platte, das experimentelle Design entspricht. Wählen Sie die vier Ecken Brunnen als Hintergrund Brunnen. Sicherstellen, dass in diesen Brunnen gibt es keine Sphäroide. Assay auf den Analyzer ausführen Klicken Sie auf die Registerkarte “Instrument Protokoll” behalten Sie die Standardeinstellung Protokollbefehle anhand " kalibrieren ", " äquilibriert " und " Baseline Messzyklus ". Klicken Sie " Injektionen " und Verbindung für jeden Port definieren. Bearbeiten Sie Messzyklen zu 6 Zyklen vom Standardwert 3 Zyklen für Sphäroide. Halten Sie die standardmäßige 3 min Mix, 0 min warten und 3 min Maßnahme Mal. Hinweis: Mix-warten-Maßnahme Standardzeiten sind 3 min, 0 min, 3 min, beziehungsweise. Vor der Injektion des zusammengesetzten erste Tests werden in der Regel drei basale Rate Messungen durchgeführt. Diese Messungen kalibriert und gemäß den Versuchsplan nachjustiert werden können. Überprüfen Sie Protokoll und Gruppenzusammenfassung. Sparen Assay Entwurfsvorlage. Fahren Sie anschließend mit Pre-Assay Kalibrierung Injektion Häfen mit Assay Substraten geladen wurden. Die Patrone mit dem Dienstprogramm Teller auf der extrazellulären Flussmittel Analyzer übertragen. Hinweis: Dies in der Regel wird innerhalb von 15-20 min abgeschlossen und kalibriert die Sensoren um OCR und ECAR Messungen durchführen. Nach der Kalibrierung der Patrone ersetzen die Dienstprogramm-Platte mit der vorgewärmten Assay-Platte mit 3D Sphäroide und initiieren den Assay. Nachdem die Messungen abgeschlossen sind, exportieren Sie die Daten in Tabelle oder Grafik und statistische Software zum Analysieren der Daten.

Representative Results

Die allgemeine Workflow für magnetische Bioprinting und extrazelluläre flux Analyse der 3D Sphäroide Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über den gesamten Prozess in diesem Protokoll beschrieben. Pankreaskarzinom-Zellen (Patu8902) und aktivierte Ganglion Zellen (PS1) wurden in Gewebe Kulturflaschen mit entsprechenden Wachstumsmedien, eine Konfluenz von 70-80 % kultiviert. Zellen wurden von der 2D Kulturgefäß freistehende und gewaschen, Zelldichte wurde ermittelt und schließlich im Wachstumsmedium 1 × 106 Zellen/ml Nukleinsäuretablette-Zellen. NS, ein Nanopartikel-Baugruppe bestehend aus Gold, Eisenoxid und Poly-L-Lysin wurde verwendet, um Zellen zu magnetisieren. Individuell magnetisierte Patu8902 und PS1 Zellen dann gemischt und auf 96-Well abweisend Zelle Wachstum Platten montiert auf einem magnetischen Sphäroid Laufwerk gedruckt. Wir haben die 15.000 um die Gesamtzahl der Zellen für die Aussaat eines einzigen Brunnens (5.000 Patu8902 Zellen gemischt mit 10.000 PS1-Zellen zu einer einzigen Sphäroid generieren) werden optimiert. Nach der Inkubation unter entsprechenden Gewebe Kulturbedingungen für 5-7 Tage wurden 3-dimensionale Sphäroide erhalten, während welcher, die Zeit das Wachstum der diese Sphäroide überwacht und aufgezeichnet wurde. Nach dem Waschen mit Assay Medien, waren Sphäroide physisch auf einem Sphäroid Mikrotestplatte metabolischen Tests mit einer extrazellulären Flux-Analyzer für die gleichzeitige Messung der Glykolyse und mitochondriale Atmung durchzuführen übertragen. Kultur und das Wachstum der pankreatischen Tumor-Fibroblasten SphäroideUm funktionelle und robuste Sphäroide zu erhalten, die epithelialen Krebszelle Linie Patu8902 und aktiviert Ganglion Zellen PS1 RPMI-1640 ergänzt mit fötalen Rinderserum kultiviert wurden. Pat8902 und PS1 Zellen magnetisiert mit NS wurden dann in einem Verhältnis von 1:2 gemischt um insgesamt 15.000 Zellen pro Bohrloch in eine Wachstumsfuge Samen. Innerhalb von 24 h die Zellen auf den Magnetantrieben zu drucken, fokale Zellen in der Mitte des Brunnens genau auf der Spitze jedes Haftmagnet unter jedem Bohrloch. Wachstum des Patu8902-PS1 Sphäroide wurde durch Bildgebung auf 2, 4, 7 und 9 Tage nach der Aussaat Zellen überwacht. Abbildung 2 zeigt die Quantifizierung der mittlere Durchmesser der repräsentativen Sphäroide zu verschiedenen Zeitpunkten oben. Der Durchmesser der Sphäroide steigt von 414 µm am Tag 2 bis 596 µm am 7. Tag Post drucken. Gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen Wachstum an den Tagen 7 und 9, und damit alle weiteren Experimente beschränkte sich auf 7 Tage Sphäroid Wachstum. Wir festgestellt, dass die Sphäroide erwerben eine schärfere Morphologie, besonders an den äußeren Rändern der NS wird schrittweise gleichmäßiger im gesamten Volumen des Sphäroids mit mehrere Tage in Kultur verbreitet. Die Sphärizität 10 Sphäroide basierend auf der Länge von ihren großen und kleinen Achsen veranschlagt Die durchschnittliche Sphärizität ist 0,92 ± 0,04 für Patu8902 allein (Tumor), 0,95 ± 0,04 für PS1 (Stromazellen) allein und 0.94 ± 0,02 für Kokultur Sphäroide. Funktionelle metabolische Assay der pankreatischen 3D Sphäroide mit der extrazelluläre Flussmittel analyzerUm die Funktionalität der Sphäroide zu testen, wir Beschäftigten metabolische und Bioenergetik Analyse der Energiebahnen in Sphäroide zu untersuchen. Wir führten eine Glykolyse Stresstest auf Sphäroide kultiviert wie oben beschrieben. Zu diesem Zweck wurden Sphäroide generiert aus entweder Patu8902 oder PS1 Zellen neben den Verpflichtungen aus einer Kokultur der zwei Zelltypen des Tests unterzogen. Interessanterweise ausgestellt alle drei Arten von Sphäroide, ob aus unterschiedlichen oder gemischte Zellen biologisch funktionale Reaktion auf die GST-Assay. Bei der Injektion einer Sättigung Konzentration von Glukose, getestet die Sphäroide Arten zeigen Erhöhungen in den glykolytischen Weg ausweislich einer Zunahme ECAR (Abbildung 3). Wenn die mitochondriale ATP-Produktion mit Oligomycin gehemmt wurde, Energieerzeugung verlagert sich auf Glykolyse und Zellen auf maximalen glykolytische Kapazität, als weitere Steigerung ECAR geschoben. Hemmung der Glykolyse mit 2-DG, einem analogen Glukose, das bindet kompetitiv Glucose Hexokinase, führte zu einem Rückgang der ECAR, bestätigt, dass die vorherige Erhöhung ECAR glykolytische Aktivität zurückzuführen. Bemerkten wir, dass die Sphäroide getestet in dieser Studie auf diese Weise reagiert, obwohl die PS1 allein Sphäroide (Durchmesser 250 µm) ein relativ niedriger Signal, möglicherweise durch ihre kleinere Größe und geringeren glykolytische Kapazität im Vergleich zu den Patu8902 Krebs hatte Zellen (Durchmesser 600 µm). In der Regel eine höhere ECAR signal von Tumorzelle abgeleitet Sphäroide im Vergleich zu denen von relativ kleiner PS1 Fibroblasten Sphäroide abgeleitet, könnte möglicherweise die Krebszellen inhärenten metabolische Neigung zur Glykolyse22zugeschrieben werden, 23. Alle drei Arten von Sphäroide stammen aus Aussaat die gleiche Anzahl von Zellen, obwohl wir Sphäroid Größe Unterschiede zwischen verschiedenen jeder Art, mit PS1 allein Sphäroide bemerkt, obwohl Sie die kleinste, gefolgt von Kokulturen Sphäroide und Patu8902 allein Sphäroide werden die größte. Um die Funktion der Mitochondrien in 3D Sphäroide testen, unterzogen wir Kokultur Sphäroide eine MST-Assay. Die MST misst wesentliche Parameter der Funktion der Mitochondrien durch direkte Messung OCR von Zellen (Abb. 4A und 4 b). Eine serielle Injektion mit Verbindungen (Oligomycin, FCCP und eine Mischung aus Rotenon und Antimycin A) wurde zur mitochondrialen Hauptparameter wie ATP Produktion, maximale Atmung und nicht-mitochondriale Atmung zu messen. Diese Parameter und basalen Atmung Preise wurden weiter zur Berechnung Proton Leck und Atemwege Reservekapazität (Abbildung 4). Eine Abnahme der OCR als Reaktion auf Oligomycin Hemmstoff der ATP-Synthase (Komplex V) entspricht die mitochondriale Atmung, verbunden mit zellulären ATP-Produktion. Sphäroide wurden mit Oligomycin für eine längere Dauer erlauben maximale Penetration und effiziente Reaktionszeit inkubiert. Eine zweite Injektion mit der Entkuppler FCCP stimuliert maximale Sauerstoff-Verbrauch und eine entsprechende Zunahme der OCR. FCCP stimuliert OCR wurde verwendet, um die Atemwege Kapazitätsreserven, ein Maß für die Fähigkeit der Zelle reagieren auf erhöhte Energiebedarf zu berechnen. Die dritte Injektion; eine Mischung aus Rotenon (ein Komplex ich Inhibitor), und Antimycin A (ein Komplex III-Hemmer) blockiert mitochondrialen Atmung, als ein starker Rückgang der OCR (Abbildung 4BOng >). Alles in allem bestätigen unsere Beobachtungen die Funktionalität des kultivierten Sphäroide mit eine extrazelluläre Flussmittel Analyzer als Maß für ihren Fußabdruck/Stoffwechselaktivität sowohl im Hinblick auf die glykolytische und mitochondriale Potenzial, wie oben beschrieben. Abbildung 1 . Schematische Darstellung der Methodik für die Kultur und Assay von Bauchspeicheldrüsenkrebs Zellen/Fibroblasten Sphäroide. Patu8902 und PS1cells wurden kultiviert, trypsiniert, gewaschen und gezählt. Für die Aussaat jedes Sphäroid, Patu8902 (5.000 Zellen/Na) und PS1 Fibroblasten (10.000 Zellen/Na) magnetisiert wurden mit NS und auf eine Zelle abweisend Wachstumsfuge am 1. Tag gedruckt. Nach der Aussaat, war der Wachstumsfuge montiert auf einem magnetischen Sphäroid-Laufwerk (mit einem Magnet unter jedem Bohrloch der Wachstumsfuge 96-well-Format) und Kultur für 2-7 Tage, 3D Sphäroide zu erhalten. Die daraus resultierende Sphäroide wurden gewaschen und übertragen Sphäroid Assay Mikroplatten, die metabolische Assays auf das extrazelluläre Flussmittel Instrument durchzuführen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 . Wachstum der pankreatischen Tumor-Fibroblasten Sphäroide. (A) ein repräsentatives Bild der Patu8902-PS1 Kokultur Sphäroid entspricht den Tag in der Kultur zeigt sich auf der Oberseite und die Größe des Durchmessers der Sphäroid (µm) ist unter quantifiziert. Progressive Zunahme Sphäroid Größe und Verbreitung von NS-Partikel (dunkle Punkte) im ganzen seines Volumens besteht zwischen 2 und 7 Tagen. Sphäroide wurden in Kultur für weitere 2 Tage danach gehalten, die nicht zu einem deutlichen Anstieg der Sphäroid Durchmesser geführt hat. (B) repräsentative Bilder der Sphäroide abgeleitet von Tumorzellen (Patu8902), Stroma (PS1) und Co kultivierten Zellen (Patu8902 + PS1) wird angezeigt. (C) Sphärizität Daten werden aus 10 einzelnen Sphäroide aus jeder Gruppe dargestellt. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung (SD). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 . Glykolyse Stresstest (GST) mit pankreatischen Sphäroide. (A) schematische Darstellung eines typischen glykolytischen Funktion-Assays mit verschiedenen Test-Parameter dargestellt. (B) ein Beispiel für eine GST-Test auf die Bauchspeicheldrüse Sphäroide kultiviert mit der Methodik beschrieben durchgeführt. Glucose Injektion Rampen Glykolyse gesehen als eine Zunahme der ECAR, mit weiteren Anstieg auf Zugabe von Oligomycin zum Absperren der mitochondrialen Atmung. ECAR verliebt sich in Reaktion auf 2-DG, eine wettbewerbsfähige Analog der Glukose, durch die Blockierung der Glykolyse. Alle Sphäroide zeichnen, eine funktionale Reaktion auf die GST-Assay auszustellen. (C) eine Leistung von der GST-Test unter Verwendung des Herstellers Reportgenerator Darstellung der drei wichtigsten Parameter des GST-Assays. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler von Mittelwert (SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4. Mitochondrialer Stress-Test (MST) mit Patu8902-PS1 Sphäroide. (A) schematische Darstellung eines typischen mitochondrialen Funktion-Assays mit verschiedenen Test-Parameter wird dargestellt. (B) ein Beispiel für eine MST auf der pankreatischen Tumor-Fibroblasten Sphäroide. (C) Kokultur 3D Sphäroide weisen eine funktionale Reaktion auf die MST-Assay. Erwartungsgemäß fiel mitochondriale Funktion gemessen als ein Rückgang der OCR als Sphäroide mit Oligomycin, ein ATP-Synthase-Inhibitor in Frage gestellt wurden. Mit FCCP, Rampe bis Elektronenfluss führte zu maximalen OCR, die sofort bei der Hemmung der mitochondrialen Atmung mit zusammengebrochen – Cocktail von mitochondrialen Komplex-Inhibitoren. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler von Mittelwert (SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Mit Bauchspeicheldrüsenkrebs, die 3^rd führende Ursache von Krebs verursachten Todesfälle in den Vereinigten Staaten²⁴, als Vorbild und Modell, eine schnelle und konsequente Methode entwickelt wurde, um wachsen und assay 3D Sphäroide mit der Kokultur, der pankreatischen Krebszellen und Pankreas Fibroblasten aktiviert. Mit magnetischen Bioprinting, wurden in einer Größe von 400-600 µm im Durchmesser Sphäroide erhalten. Diese waren metabolischen Tests erfolgreich die Funktionalität des kultivierten 3D Sphäroide testen unterzogen. Diese Methode ist einfach, konsequent und kann leicht an andere Zelltypen angepasst werden.

Während diese Methode beschleunigen und translational, die Assays mit 3D Sphäroide durchgeführt geben wird, kann es durch die Entwicklung von Techniken, mit denen multiplexing der Sphäroid Manipulation und Handhabung verbessert werden. Dies sollte die gesamte Zeit, Kosten und Arbeitsaufwand für die Durchführung des Tests weiter verringern. Darüber hinaus können Sphäroid Bände zur OCR-Signale wie von anderen berichtet⁶zu normalisieren. Sphäroid Volumen normalisiert durch durchschnittliche Volumen einer Zelle könnte verwendet werden, um OCR pro Zelle zu bestimmen, aber da Wachstum der Sphäroide nicht identisch sein wird, eine absolute OCR pro Zelle berechnen könnte schwierig sein. Derzeit wird diese Methode durch den Mangel an ein effizientes Werkzeug zu Multiplex-Sphäroid Handhabung und Übertragung von Wachstumsfugen zu Umwelt assay begrenzt.

Die beschriebene Methode ist geändert und von der magnetischen Bioprinting Technologie angepasst und weiter validiert, um die funktionelle Relevanz zu zeigen, indem der kultivierten Sphäroide auf ein nachgeschalteter metabolische Assay. Die Methode stellt ein wichtiges Instrument, um robuste, lebensfähigen und funktionale Sphäroide zu generieren, die enthalten die zwei wichtigsten Zelltypen gefunden in den meisten Tumorgewebe, Krebszellen und Krebs Fibroblasten, die für andere investigational Assays eingesetzt werden können, wie Drogen-Bildschirme. Die relative Einfachheit und Effizienz der NS-Methodik ist eine Hauptverbesserung über andere Methoden²⁵, wie z. B. die hängenden drop Methode²^,²⁶ Sphäroid Generation.

Robuste Sphäroide generiert als solche stellen eine in-vitro- Tumor Modell, die stromale Zellen enthält, die oft von vielen 3D Culture Studien fehlen. Die Möglichkeiten für die Anwendung der so generierte 3D Sphäroid Modelle sind enorm. Zum Beispiel können solche Modelle, Zell-Zell-Interaktionen, Bioenergetik Schichten zu untersuchen und testen Sie genetische Anfälligkeit und Abhängigkeit von verschiedenen therapeutischen Therapien eingesetzt werden. 3D Sphäroide, die in Vivo Tumor Mikroumgebung rekapitulieren dienen als höchst relevante und nützliche Tool für Drogen-screening-Studien und die Erforschung der Mechanismen der Wirkung von aktuellen und neuartiger Therapeutika. Metabolische Assays sondieren Energiebahnen mit Sphäroide Kulturen mit mutierten Zellen helfen können, neues Licht in die Rolle der Gene und damit verbundenen Wege in der Pathobiologie in einem entsprechenden 3D-Modell von Krebs, wie die in dieser Studie beschriebenen Sphäroide.

Die erfolgreiche Anwendung dieser Methode beruht vor allem auf die Gesundheit der Zellen erforderlich für den magnetischen Druck, weshalb Zelle wächst in der logarithmischen Phase geerntet und magnetisiert werden. Es ist entscheidend für die magnetische Sphäroid-Laufwerk verwenden, um drucken magnetisierten Zellen und nicht der Holding-Antrieb, der nur während der Sphäroid waschen und Medien auffüllen Schritte des beschriebenen Verfahrens genutzt werden sollte. Andere die wichtigste Aspekt für erfolgreiche Auslesen der metabolischen Tests ist die Morphologie der Sphäroide während der Übertragung von der Wachstumsfuge an der Assay-Platte.

Insgesamt hat dieses Protokoll für die Erzeugung von 3D Sphäroide etabliert, die Krebs und Stromazellen Zellen, nach der anschließenden metabolische Test der Sphäroide mit extrazellulären Flussmittel Analyzer enthalten. Die wichtigsten Merkmale dieser Methode sind, dass es schnell, leicht anpassbar und konsistente, relevant ist und die in Vivo Tumor Mikroumgebung imitiert, vergleichsweise kostengünstig ist und als ein neues Tool dienen kann für Tumorbiologie zu studieren und zu entwickeln Anti-Krebs Agenten.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten danken Samuel Zirbel für Unterstützung bei der Optimierung der Kulturbedingungen und Überwachung Sphäroid Wachstum. Wir sind dankbar, Agilent Technologies für die Bereitstellung der Seepferdchen XF^e96 Analyzer, Assay Reagenzien und technischen Erkenntnissen. Wir danken auch Dr. Hemant Kocher bei Barts Cancer Institute in Großbritannien für die Bereitstellung der PS1-Zellen. Diese Arbeit wurde teilweise von der Seena Magowitz Stiftung für Pancreatic Cancer Research und ein stehen bis zu Krebs Forschung UK-Lustgarten Stiftung pankreatischen Krebs Dream Team Research Grant unterstützt (Grant Number: SU2C-AACR-DT-20-16). Stand Up To Cancer ist ein Programm der Stiftung Unterhaltung Industrie. Stipendien werden von der American Association for Cancer Research, der wissenschaftliche Partner der SU2C verabreicht.

Materials

0.05% Trypsin EDTA	Sigma	25300-054
96 well cell repellant plate	USA Scientific/ Griener Bio-One	655970	spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
D-Glucose	Sigma	D9434
DPBS	Gibco	14190-144
Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
L-Glutamine	Sigma	59202C
Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent Technologies	103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C
Patu8902 cells	Laboratory Stock		pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells	Laboratory Stock		activated pancreatic stellate cells
RPMI1640	Gibco	11875-093	growth media for cells, spheroids
SeaHorse XF^e96 extracellular flux analyzer	Agilent Technologies		extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636
XF Base media	Agilent Technologies	102365-100	base media for metabolic assays on XF^e96

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3D Spheroid Co-culture Pancreatic Cancer Cells Fibroblasts Metabolic Assay Extracellular Flux Analysis Tumor Microenvironment Cell Magnetization Nanoshuttle Magnetic Spheroid Drive

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Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).