Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Pawan Noel; Ruben Mu&#241;oz; George W. Rogers; Andrew Neilson; Daniel D. Von Hoff; Haiyong Han

doi:10.3791/56081

JoVE Journal > Cancer Research

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Kanser Araştırmaları

Préparation et test métabolique des co-cultures 3-dimensional sphéroïde de fibroblastes et de cellules de cancer du pancréas

Published: August 23, 2017

doi:

10.3791/56081

Pawan Noel¹, Ruben Muñoz¹, George W. Rogers², Andrew Neilson², Daniel D. Von Hoff¹, Haiyong Han¹

¹Molecular Medicine Division,Translational Genomics Research Institute, ²Agilent Technologies

Özet

Ici, on décrit une méthode pour la préparation de 3 Dimensions (3D) sphéroïde co-culture de cellules de cancer du pancréas et des fibroblastes, suivies de la mesure des fonctions métaboliques à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire.

Abstract

De nombreux types de cancer, y compris le cancer du pancréas, ont un stroma fibreux dense qui joue un rôle important dans la progression tumorale et l’invasion. Les fibroblastes activés cancer associé sont une composante clé du stroma tumoral qui interagissent avec les cellules cancéreuses et de soutenir leur croissance et leur survie. Les modèles qui récapitulent l’interaction des cellules cancéreuses et activé les fibroblastes sont des outils importants pour l’étude de la biologie stromale et pour le développement d’agents antitumoraux. Ici, on décrit une méthode pour la génération rapide de co-culture robuste sphéroïde (3D) 3-dimensions des cellules de cancer du pancréas et activés fibroblastes du pancréas qui peuvent être utilisés pour des études biologiques ultérieures. En outre, décrit est l’utilisation des sphéroïdes 3D dans l’exécution des essais fonctionnels métaboliques pour sonder les voies de bioénergétique cellulaire à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire couplée à une sphéroïde de microplaque. Des cellules de cancer du pancréas (Patu8902) et des fibroblastes activés pancréatique (PS1) ont conjointement mis en culture et aimantés à l’aide d’une NANOPARTICULE biocompatible. Les cellules magnétisés sont rapidement bioprinted à l’aide de disques magnétiques dans un format de 96 puits, dans les milieux de croissance pour générer des sphéroïdes avec un diamètre compris entre 400 et 600 µm dans les 5-7 jours de culture. Tests métaboliques fonctionnels utilisant des sphéroïdes Patu8902-PS1 ont été effectuées puis à l’aide de la technologie de flux extracellulaire pour sonder les voies énergétiques cellulaires. La méthode est simple, permet la génération cohérente du cancer cell-fibroblaste sphéroïde co-cultures et peut être potentiellement adaptée aux autres types de cellules du cancer sur l’optimisation de la méthodologie décrite actuelle.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, les nombreux- in vitro -3D-modèles ont été développés pour récapituler et enquêter sur les in vivo tumeur biologie microenvironnement conditions et croissance des cellules de cancer¹^,². Culture systèmes bénéficiant d’une orientation uniforme aux facteurs biochimiques et composés expérimentaux ne parviennent pas à reproduire des interactions tumeur-stroma 3D natives exposées à un gradient de composés diffusant à travers l’extracellulaire de cellulaire bidimensionnel monocouche (2D) matrice de protéines (ECM)³^,⁴. Ainsi, en comparaison de modèles de culture de tissus 2D, 3D cancer modèles ont vu le jour pour montrer mieux potentiels à simuler le microenvironnement tumoral et a servi des outils importants pour mieux comprendre en vivo tumeur caractéristiques telles que l’hypoxie, desmoplasia, dormance, pénétrance de drogue, la toxicité et la résistance thérapeutique⁵^,⁶. À cette fin, des modèles 3D sont susceptibles de combler le fossé entre la culture cellulaire 2D et les modèles animaux en imitant en vivo caractéristiques de tumeur, tout en étant relativement peu coûteux et optimisée pour la génération rapide et de cohérence. Ces avantages sont exploitées afin d’accélérer la recherche translationnelle dans de nombreux domaines, y compris la biologie du cancer, morphogenèse et⁷^,⁸en génie tissulaire.

Dans un élan de l’évolution des méthodes de culture de tissu 3D, techniques de lévitation magnétique récemment ont été mis au point et décrits pour la croissance, dosage et d’imagerie des sphéroïdes dérivé de diverses cellules types⁹^,¹⁰^, ¹¹ ^, ¹². magnétique bioprinting 3D exploite l’utilisation des forces magnétiques à l’ingénieur des tissus par magnétisant des cellules avec des nanoparticules biocompatibles et de les imprimer en formats multipuits. Ceci permet la production rapide de cohérent, près de sphéroïdes 3D identiques, ce qui peuvent être exploitées et utilisées pour une multitude d’applications en aval pour enquête biochimiques et biophysiques¹⁰. Ici, nous avons adapté la technique bioprinting magnétique à l’aide d’un matériau biocompatible, appelé Nanoshuttle (NS) composé d’oxyde de fer, poly, L-lysine et or nano particules d’étiqueter les fibroblastes et les cellules de cancer du pancréas. NS se fixe électrostatiquement sur la membrane plasmique, ne sait pas se lier à des récepteurs spécifiques, et communiqués au large de la cellule de surface en une semaine. Il faut les forces magnétiques très faibles (30pN), assez pour total, mais pas mal de cellules et n’affecte pas la viabilité cellulaire, métabolisme ou prolifération de le rendre extrêmement biocompatibles pour cultures 3D¹⁰^,¹³^,¹⁴ ^,,¹⁵.

Dans cette étude, à l’aide d’un cancer du pancréas comme un exemple et un modèle, nous décrivons la génération et l’analyse métabolique des sphéroïdes de cellule-fibroblaste cancer 3D. À partir de cellules cultivées dans des récipients 2D, nous illustrons les conditions de culture et de la croissance des sphéroïdes de co-culture de tumeur pancréatique-fibroblaste utilisant bioprinting magnétique. Sphéroïdes cultivées ont ensuite été utilisés dans des tests métaboliques fonctionnels à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire, une technologie démontrée pour mesurer simultanément les deux voies de production énergétique, la glycolyse et la respiration mitochondriale, dans une variété de direct cellules et tissus¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. La glycolyse a été mesurée comme un changement dans le taux d’acidification extracellulaire (ECAR), tandis que la respiration mitochondriale ou la phosphorylation oxydative a été mesurée comme le taux de consommation d’oxygène (OCR). Nous proposons que cette méthode développée pour sphéroïdes tumeur pancréatique peut servir comme une épine dorsale pour optimiser et traduction de génération de sphéroïde de tumeur 3D et dosage à d’autres types de cellules et les tissus.

Protocol

1. culture du Cancer pancréatique sphéroïdes 3D à l’aide de Bioprinting magnétique technique de Using standard culture aseptique des tissus, des cellules de culture de participation dans un flacon, T75 à une confluence de 70 à 80 % dans les milieux de culture appropriés. Remarque : En général, 5-7 × 10 6 cellules d’une fiole de T75 confluente de 70-80 % ont été récoltés. Deux types de cellules différentes ont été utilisées dans cette étude – Patu8902 (cellules tumorales du pancréas) et PS1 cellules (cellules étoilées du pancréas activés 21). Les deux lignées cellulaires ont été cultivées dans des milieux de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) additionné de 10 % (v/v) fœtale bovine serum(FBS), 1 × pénicilline-streptomycine (p/s). Laver les cellules une fois avec 5 mL de Dulbecco ' tamponnée au phosphate de s saline(DPBS). Détacher les cellules en plastique de surface par trypsinisation avec 2 mL de 0.05 % trypsine-EDTA pendant 5-10 min à 37 ° C. Vérifiez pour le détachement des cellules au microscope. Désactiver la trypsine par ajout de 8 mL de milieu de croissance à détaché des cellules. Éviter la trypsinisation, car cela peut nuire à la santé/la viabilité des cellules. Cellules de pipette up et down pour générer une suspension monocellulaire et comte de cellules densité à l’aide d’un compteur de cellules automatisées ou un hémocytomètre. Dans l’intervalle, équilibrer un flacon de NS à la température ambiante. Calculer la quantité de cellules nécessaires pour ensemencer le nombre désiré de sphéroïdes (puits) et partie aliquote dans un nouveau tube conique de 15 mL. Par exemple, à la postérité un entier 96 plaque bien avec 5 000 cellules/puits, cellules 5 partie aliquote au moins 5,5 × 10. Cellules virés par centrifugation à 500 g pendant 3 min. soigneusement aspirer ou éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules à une concentration de 1,0 x 10 6 cellules/mL dans les milieux de culture. Déposer délicatement à l’aide d’un embout large ennuyé pour éviter le cisaillement. Par exemple, remettre 5,5 x 10 5 cellules dans 550 µl de milieux de culture. Aimanter la quantité désirée de cellules à l’aide de la NS équilibré (pas 1.6). Directement ajouter NS à la suspension de cellules dans les milieux de culture et agiter doucement. Pour l’étiquetage magnétique efficace des cellules, utilisez 10 µL NS par 100 µL de cellules (remis en suspension à 1 x 10 6 cellules/mL). Remarque : Pour une expérience typique, étiquette de 5,5 × 10 5 Patu8902 cellules dans 550 µL avec 55 µL NS et 1,1 × 10 6 PS1 pour 1100 µL, (séparément) avec 110 µL NS. Doucement inverti tube quelques fois pour assurer la suspension cellulaire. Temporairement, transférer le mélange cellulaire-NS dans un seul puits d’une plaque 24 puits. Le faire séparément pour chaque type de cellule à magnétiser. Plaque de recouvrement et incuber les cellules à température ambiante pendant 2 h avec agitant doucement pour autoriser la liaison NS à la surface de la cellule. NOTE : Culture et dosage des sphéroïdes à partir soit de cellules seuls Patu8902 ou PS1, en plus des sphéroïdes de co-culture commençant par les deux types prémélangées avant impression sur disques magnétiques a été réalisée avec succès en utilisant cette méthode de l’independent de cellules. expériences. Une méthode pour générer des sphéroïdes de co-culture de cellules Patu8902 et PS2 est décrit ci-dessous dans les étapes subséquentes. Pipette et descendre les cellules magnétisées doucement pour mélanger uniformément et préparer un mélange maître contenant le numéro de la cellule souhaitée. Pour l’ensemencement des sphéroïdes, utiliser un total de 15 000 cellules (5 000 Patu8902 + 10 000 PS1) et s’adapter à un volume total de 150 µL / puits d’une plaque de 96 puits. Remarque : Le volume final distribué dans chaque puits doit être le même quel que soit le nombre de cellules utilisées. Posez une plaque à 96 puits répulsive cellulaire placé sur le disque magnétique 96 puits sphéroïde et distribuer 150 µL du mélange de cellules dans chaque puits. Observer les cellules lentement à frais virés au centre du puits au-dessus de l’aimant. Couvrir et laisser incuber la plaque du jour au lendemain dans une étuve à 2 CO 5 % mis à 37 ° C avec le disque magnétique sphéroïde encore attaché. Retirez le disque magnétique et incuber une croissance additionnelle jusqu’à 7 jours. Remarque : Il est essentiel d’utiliser des plaques de croissance cellulaire répulsif pour l’impression de sphéroïde en utilisant des disques magnétiques sphéroïde. Assurez-vous que le disque de sphéroïde avec aimants plus petits plus minces est utilisé, pas le lecteur tenue. Contrôler la croissance des sphéroïdes tous les jours. Reconstituer avec les milieux de culture fraîche tous les trois jours en plaçant la plaque de croissance montée sur le magnétique tenant en voiture à un angle et en utilisant une pipette multicanaux pour en tirer des médias usés. Remarque : Patu8902 et PS1 cellules injectées conjointement à 15 000 cellules/puits seront développera en sphéroïdes 3D avec un diamètre de 400 à 600 µm dans les 5 à 7 jours. À ce stade les sphéroïdes sont prêts pour la caractérisation métabolique, évaluation des médicaments et d’autres applications en aval. 2. Analyse métabolique des sphéroïdes de tumeur pancréatique 3D pour bioénergétique de voies à l’aide de l’analyseur de Flux extracellulaire Remarque : dans cette section, l’analyse des fonctions métaboliques des sphéroïdes à l’aide d’un flux extracellulaire analyseurs de microplaques test spécialement conçu pour la 3D sphéroïdes est décrite. Laver, transfert des sphéroïdes de plaques de croissance au sphéroïde dosage microplaques. NOTE : Sphéroïdes peuvent servir pour des analyses métaboliques lorsqu’ils atteignent un diamètre de ~ 500 µm. La veille de la réalisation de l’essai, hydrater la cartouche sonde ou capteur avec dosage calibrant (200 µL/puits) dans la plaque de l’utilitaire fourni et incuber pendant la nuit (4-18 h) dans un incubateur humidifié (non-CO 2) fixé à 37 ° C. Préparer le milieu approprié pour le dosage désiré métabolique en ajoutant le support de base (voir la Table des matières) avec un dosage de 2 mM de L-glutamine pour épreuve d’effort de la glycolyse (TPS) ou avec le pyruvate de 1 mM, 2 mM de L-glutamine et 10 mM de glucose pendant une Test test de stress mitochondrial (MST). Remarque : L’analyseur de flux extracellulaire mesure aussi bien la respiration mitochondriale (OCR) et la glycolyse (ECAR) de cellules vivantes dans un format de plaque à 96 puits. Ces tarifs donnent un aperçu de la fonction métabolique cellulaire dans les échantillons incriminés. Veuillez consulter le manuel dans les trousses de dosage pour obtenir des instructions détaillées. Après ajout de dosage des compléments spécifiques (voir étape 2.1.1), chauffer le milieu supplémenté dans un bain-marie à 37 ° C et ajuster le pH à 7,4 ± 0,1 à 0, 1N NaOH. Garder le milieu chaud jusqu’à utilisation. Reconstituer dosage des réactifs dans le milieu de dosage calibrée à des concentrations de stock recommandées. NOTE : Ils sont réalisés à 10 × la concentration finale souhaitée dans les puits. Concentrations de stock pour le glucose, l’oligomycine et 2-désoxy-glucose (2-DG) sont respectivement de 100 mM, 100 µM et 500 mM,. Observer sphéroïdes dans la plaque de croissance sous une lumière microscope pour vérifier pour la morphologie sphéroïde et uniformité globale ; en ce qui concerne la forme et la structure des sphéroïdes. Transfert de la plaque de croissance sur un disque magnétique holding et aspirer soigneusement les milieux de culture ~ 120 µL. Doucement, laver sphéroïdes ~ 120 µL de médias de dosage réchauffée et précalibré, aspirer et répéter le lavage deux fois. Inspecter les sphéroïdes au microscope pour vérifier que les sphéroïdes ne sont pas lavés. Préparer la microplaque de dosage sphéroïde en ajoutant des médias de dosage chaud 180 µL à chaque puits. Définir une micropipette P20 à 10 µL et insérez un bout large s’ennui à elle. Si large s’ennuie astuces ne sont pas disponibles, couper l’extrémité des pointes de pipette ordinaire avec un ciseaux propre ou un scalpel pour élargir l’alésage. Remarque : Cela devrait réduire la tonte et préserver la morphologie globale des sphéroïdes lors de son transfert pour plaques de dosage. Permet d’effectuer un transfert des sphéroïdes une surface chaude (37 ° C). Utilisez une surface de visionneuse de film x-ray chauffée avec une lampe à lumière blanche pour renforcer le contraste et la visualisation des sphéroïdes lors du transfert de l’aide. Soigneusement aspirer un sphéroïde prélavée unique de la plaque de croissance cellulaire hydrofuge à l’aide d’une micropipette P20 muni d’une échelle d’alésage Astuce et doucement sphéroïde de transfert directement dans le centre de chaque puits d’une plaque d’essai de sphéroïde pour mener à bien le métabolisme dosage. Permettre à chaque sphéroïde doucement tomber dans la chambre-micro centrale de chaque puits par gravité pure pour remplir la plaque d’essai. Remarque : Il faut habituellement 5-8 s pour chaque sphéroïde de tomber dans le centre du puits de gravité. Ne tirez pas la pipette jusqu’à ce que les sphéroïdes sont installés dans le micro de la chambre. Faire pas dépôt sphéroïdes dans les puits de 4 coin de la plaque d’essai (A1, A12, H1, H12) puisque ce sera utilisée comme puits de fond. Contrôler la morphologie et la position de chaque sphéroïde pour s’assurer que chaque sphéroïde est au centre de chaque puits. Si nécessaire, repositionner au centre du puits en aspirant sur l’ellipsoïde à l’aide d’une échelle d’alésage embout et le dépôt subséquent par gravité. Une fois que tous les sphéroïdes ont été transférés, placer la plaque de test dans un incubateur à 37 ° C l’air humidifié (non-CO 2) pour une heure avant dosage. Cartouche de sonde avec des composés et de réalisation de l’essai de chargement Prepare 10 × concentré de dosage des réactifs spécifiques dans les médias spécifiques de dosage indiqués au point 2.1.2. Par exemple, pour exécuter GST, reconstituer la glucose, l’oligomycine et 2-DG en volumes recommandés mentionnés dans le manuel de dosage. Tests de TPS et de MST ont été réalisées à l’aide de Patu8902-PS1 sphéroïdes. Correctement orienter la cartouche de sonde avec lignes marquées A-H sur le côté gauche et placer un guide de chargement sur le dessus de la cartouche de la sonde. Assurer le chargement correct de port souhaité en orientant le guide de chargement jusqu’à ce que la lettre correspondant au port pour charger le coin supérieur gauche. à l’aide d’une pipette multicanaux, diluer réactifs directement dans des ports de l’injection. Tenir les guides de chargement à l’aide des doigts tout au long de la procédure. Remarque : Chaque réactif est injecté dans un port recommandé mentionné dans le manuel de dosage. Éviter de créer des bulles d’air, mais ne pas taper n’importe quelle partie de la cartouche pour éliminer les bulles d’air. Supprimer le guide de charge et la position au niveau des yeux avec cartouche pour inspecter visuellement les ports d’injection pour le même chargement. Créer le protocole de conception/instrument d’essai expérimental à l’aide du contrôleur d’instrument logiciel Wave (dorénavant, les logiciels d’analyse) tel que décrit à la section 2.3. Assay conception et l’exécution en utilisant le logiciel d’analyse créer un modèle de test pour l’expérience Ouvrez le logiciel d’analyse, puis cliquez sur " modèles " ou choisir un test existant modèle. Double-cliquez sur " modèle vierge ". Définir les groupes expérimentaux et les conditions. Stratégies d’Injection à définir pour les ports A, B et C. congé vide de port D. Remarque : Pour l’analyse de la GST, seuls ces ports seront chargés avec le Glucose, l’oligomycine et DG-2. En cas de test de MST, l’oligomycine, FCCP et la roténone seront chargés. Définir les prétraitements si sphéroïdes ont été traités avec un ou plusieurs composés d’essai et le groupe témoin. Définir les médias analyse pour inclure la source, les suppléments et autres renseignements. Définir un ou plusieurs type de cellules (par exemple Patu8902, PS1) Voir les informations de densité et de passage numéro. Cliquez " générer des groupes ". Cliquez " plaque carte " onglet et affecter des groupes à la plaque d’essai correspondant à la conception expérimentale. Sélectionner les puits les quatre angles comme puits de fond. S’assurer qu’il n’y a aucun sphéroïdes dans ces puits. Exécuter l’essai sur l’analyseur cliquez sur l’onglet Instrument protocole garder la valeur par défaut des commandes de protocole en vérifiant " Calibrate ", " stabiliser " et " Cycle de mesure de référence ". Click " Injections " et définir pour chaque port. Modifier les cycles de mesure à 6 cycles par défaut 3 cycles pour sphéroïdes. Garder la combinaison de 3 min par défaut, attente 0 min et temps de mesure de 3 min. Remarque : Délais d’attente-mix-mesure par défaut sont respectivement de 3 min, 0 min, 3 min. Trois mesures de débit de base sont généralement prises avant l’injection du premier dosage de composés. Ces mesures peuvent être étalonnés et réajustés selon le protocole expérimental. Examiner le protocole et groupe Résumé. Enregistrer le modèle de conception de test. Procéder au dosage avant étalonnage une fois que les ports d’injection ont été chargés avec des substrats de dosage. Transférer la cartouche avec la plaque de l’utilitaire à l’analyseur de flux extracellulaire. Remarque : Cela se termine dans 15-20 min habituellement et étalonne les capteurs pour effectuer des mesurages de l’OCR et ECAR. Après l’étalonnage de la cartouche, replacez la plaque de l’utilitaire avec la plaque d’essai préchauffé contenant 3D sphéroïdes et lancer le test. Quand les mesures sont faites, exporter les données dans la feuille de calcul ou des logiciels graphiques et statistiques pour analyser les données.

Representative Results

Le déroulement général bioprinting magnétique et analyse de flux extracellulaire des sphéroïdes 3D La figure 1 illustre un aperçu de l’ensemble du processus décrit dans le présent protocole. Les cellules de cancer du pancréas (Patu8902) et les cellules stellaires activées (PS1) ont été cultivés dans des flacons de culture cellulaire contenant des milieux de culture appropriés à une confluence de 70 à 80 %. Les cellules ont été détachés depuis le récipient de culture 2D et lavé, densité cellulaire a été déterminée et cellules enfin remis en suspension dans des milieux de culture à 1 × 106 cellules/mL. NS, une Assemblée de nanoparticules consistant en or, oxyde de fer et de la poly-L-lysine a servi à magnétiser les cellules. Des cellules Patu8902 et PS1 magnétisés individuellement ont été ensuite mélangées et imprimés sur des plaques de 96 puits croissance cellulaire répulsif montés sur un disque magnétique sphéroïde. Nous avons optimisé le 15 000 pour être le nombre total de cellules pour l’ensemencement d’un puits unique (5 000 cellules Patu8902 mélangés à 10 000 cellules PS1 pour générer un sphéroïde unique). Après incubation dans des conditions appropriées de culture tissulaire pendant 5 à 7 jours, 3-dimensional sphéroïdes ont été obtenus, au cours de laquelle la croissance de ces sphéroïdes a été contrôlée et enregistrée. Après le lavage avec médias de dosage, sphéroïdes étaient physiquement transférés sur une microplaque sphéroïde pour effectuer des tests métaboliques à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire pour la mesure simultanée de la glycolyse et de la respiration mitochondriale. Culture et croissance des sphéroïdes tumeur pancréatique-fibroblastePour obtenir des sphéroïdes fonctionnels et robustes, les cellules épithéliales cancéreuses line Patu8902 et activation des cellules étoilées PS1 ont été cultivées en milieu RPMI-1640 additionné de sérum de veau fœtal. Pat8902 et cellules PS1 magnétisés avec NS ont été ensuite mélangés dans un ratio de 1:2, afin d’amorcer un total de 15 000 cellules par puits dans une plaque de croissance. Moins de 24 h d’imprimer des cellules sur les disques magnétiques, cellules focalisée au centre du puits exactement sur le dessus de chaque goupille magnétique dans chaque puits. Croissance des sphéroïdes Patu8902-PS1 a été suivie par l’imagerie jours 2, 4, 7 et 9 après l’ensemencement des cellules. La figure 2 illustre la quantification du diamètre moyen des sphéroïdes représentatifs à divers moments ci-dessus. Le diamètre des sphéroïdes augmente de 414 µm sur jour 2 à 596 µm sur jour 7 post impression. Il n’y avait pas de différence significative entre la croissance les jours 7 et 9, et ainsi tous les autres expérimentations a été limitée à 7 jours de croissance sphéroïde. Nous avons remarqué que les sphéroïdes acquièrent une morphologie plus nette, surtout sur les bords externes et le NS est progressivement plus uniformément répandue dans tout le volume de l’ellipsoïde avec plusieurs jours de culture. Nous avons également estimé la sphéricité des 10 sphéroïdes basé sur la longueur de leurs axes majeurs et mineurs. La sphéricité moyenne est 0,92 ± 0,04 pour Patu8902 seul (tumeur), de 0,95 ± 0,04 pour PS1 (stroma) seul et 0.94 ± 0,02 pour sphéroïdes de co-culture. Test métabolique fonctionnel du pancréas sphéroïdes 3D à l’aide de la Analyseur de flux extracellulairePour tester la fonctionnalité des sphéroïdes, nous avons utilisé métabolique et l’analyse bioénergétique pour sonder les voies énergétiques en sphéroïdes. Nous avons effectué un test de stress de glycolyse sur sphéroïdes cultivés comme décrit ci-dessus. À cette fin, sphéroïdes générés à partir des cellules Patu8902 ou PS1 en plus de ceux qui résultent d’une co-culture des deux types cellulaires ont été soumis à l’essai. Fait intéressant, les trois types de sphéroïdes, qu’ils proviennent de cellules distinctes ou mixtes, manifestent une réaction biologiquement fonctionnelle à l’analyse de la GST. À injecter une concentration saturante de glucose, les types sphéroïdes testé Voir la hausse dans la voie glycolytique, comme en témoigne l’augmentation ECAR (Figure 3). Lorsque, à la production d’ATP mitochondriale est inhibée en utilisant l’oligomycine, production d’énergie se déplace vers la glycolyse et poussé des cellules à maximale capacité glycolytique, considérée comme la nouvelle augmentation ECAR. Inhibition de la glycolyse en utilisant 2-DG, un glucose analogique qui lie competitivement glucose hexokinase, a résulté en une diminution ECAR, confirmant que l’augmentation préalable ECAR était due à une activité glycolytique. Nous avons remarqué que les sphéroïdes testés dans cette étude ont répondu de cette façon, même si les sphéroïdes seuls PS1 (diamètre moyen 250 µm) avaient un signal relativement faible, probablement à cause de leur petite taille et capacité glycolytique plus faible par rapport au cancer Patu8902 cellules (diamètre moyen 600 µm). En général, un ECAR supérieur du signal de cellules tumorales dérivées sphéroïdes comparés à ceux de fibroblaste de PS1 relativement plus petit dérivé des sphéroïdes, pourrait éventuellement être attribuée à inhérente métabolique tendance des cellules cancéreuses glycolyse22, 23. Les trois types de sphéroïdes proviennent de semis le même nombre de cellules, même si nous avons noté la variation de taille de sphéroïde entre chaque type, avec PS1 sphéroïdes seuls étant le plus petit, suivie des sphéroïdes de co-culture, et Patu8902 seuls sphéroïdes étant le plus grand. Pour tester la fonction mitochondriale en sphéroïdes 3D, nous avons soumis des sphéroïdes de co-culture à un test de MST. Le MST mesure les principaux paramètres de la fonction mitochondriale en mesurant directement les OCR de cellules (Figure 4A et 4 b). Une injection de série avec des composés (l’oligomycine, FCCP et un mélange de roténone et l’antimycine A) a été utilisée pour mesurer des paramètres mitochondriales clés tels que la production ATP, la respiration maximale et la respiration mitochondriale-non. Ces paramètres et le taux de respiration basale servaient davantage à calculer la fuite de protons et de rechange capacité respiratoire (Figure 4). Une diminution de l’OCR en réponse à l’oligomycine, un inhibiteur de l’ATP synthase (complexe V) correspond à la respiration mitochondriale liée à la production d’ATP cellulaire. Sphéroïdes sont incubées avec l’oligomycine pour une durée plus longue permettre une pénétration maximale et temps de réponse efficace. Une deuxième injection avec découpleur FCCP stimule la consommation maximale d’oxygène et une augmentation correspondante de l’OCR. L’OCR stimulée par le FCCP a servi à calculer les capacités respiratoires, une mesure de la capacité de la cellule de répondre à la demande accrue d’énergie. La troisième injection ; un mélange de roténone, (un complexe j’ai inhibiteur) et l’antimycine A (un inhibiteur du complexe III) bloque la respiration mitochondriale, considérée comme une forte diminution OCR (Figure 4BONG >). Dans l’ensemble, nos observations confirment la fonctionnalité des sphéroïdes cultivées en utilisant un analyseur de flux extracellulaire en guise de leur empreinte/activité métabolique tant en termes de potentiel glycolytique et mitochondriale comme décrit ci-dessus. Figure 1 . Représentation schématique de la méthodologie pour la culture et le dosage des sphéroïdes de cancer pancréatique cellules/fibroblaste. Patu8902 et PS1cells ont été cultivées, trypsinisées, lavés et comptés. Pour l’amorçage chaque ellipsoïde, Patu8902 (5 000 cellules/puits) et fibroblastes PS1 (10 000 cellules/puits) étaient aimantés à l’aide de NS et imprimé sur une plaque de croissance cellulaire répulsif au jour 1. Après l’ensemencement, le cartilage de conjugaison a été monté sur un disque magnétique sphéroïde (avec un aimant sous chaque puits de la plaque de croissance de format bien 96) et a permis à la culture pendant 2 à 7 jours obtenir des sphéroïdes 3D. Les sphéroïdes qui en résultent ont été lavés et transférés à la microplaque de dosage sphéroïde pour effectuer les tests métaboliques sur l’instrument de flux extracellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 . Croissance des sphéroïdes tumeur pancréatique-fibroblaste. (A) une image représentative de sphéroïde de co-culture de Patu8902-PS1 correspondant au jour dans la culture est montrée sur le dessus et la taille du diamètre de l’ellipsoïde (µm) est quantifiée ci-dessous. Augmentation progressive de la taille de sphéroïde et de diffusion des particules de NS (pixels morts) tout au long de son volume est évidente entre 2 et 7 jours. Sphéroïdes sont restés dans la culture pendant 2 jours supplémentaires après cela, qui n’a pas entraîné une augmentation significative de diamètre sphéroïde. (B) photos représentant des sphéroïdes dérivées de cellules tumorales (Patu8902), les cellules de stroma (PS1) et conjointement des cellules (Patu8902 + PS1) s’affiche. Données de sphéricité (C) sont représentées de 10 sphéroïdes individuels de chaque groupe. Barres d’erreur représentent déviation standard (SD). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 . Glycolyse Stress Test (TPS) avec sphéroïdes pancréatiques. (A) Représentation schématique d’un test de fonction glycolytique typique avec différents paramètres de dosage représenté. (B) un exemple d’un test de GST effectuée sur les pancréas sphéroïdes cultivées à l’aide de la méthode décrite. Rampes d’injection de glucose jusqu’à la glycolyse, considéré comme une augmentation ECAR, avec une augmentation supplémentaire sur l’ajout de l’oligomycine pour couper la respiration mitochondriale. ECAR tombe en réponse au 2-DG, un analogue de la concurrence du glucose, en bloquant la glycolyse. Tous les sphéroïdes sont notés à exposer une réponse fonctionnelle à l’analyse de la GST. (C) une sortie de l’essai de la GST en utilisant le générateur de rapports par le fabricant, représentant les trois principaux paramètres de l’essai de la GST. Barres d’erreur représentent écart-type de la moyenne (SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. La figure 4. Stress Test mitochondriale (MST) avec Patu8902-PS1 sphéroïdes. (A) Représentation schématique d’un test de la fonction mitochondriale typique avec différents paramètres de dosage est représentée. (B) un exemple d’une MST sur le sphéroïde de fibroblastes-tumeur pancréatique est montré. Sphéroïdes 3D (C) la co-culture présentent une réponse fonctionnelle à l’analyse de MST. Comme prévu, la fonction mitochondriale mesurée comme un déclin de l’OCR a été remarquée lorsque sphéroïdes ont été contestés avec l’oligomycine, un inhibiteur de l’ATP synthase. Utilisant le FCCP pour accélérer le flux d’électrons a entraîné OCR maximale, qui s’est effondré immédiatement sur l’inhibition de la respiration mitochondriale en utilisant un – mélange d’inhibiteurs complexes mitochondrique. Barres d’erreur représentent écart-type de la moyenne (SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Décès à l’aide d’un cancer du pancréas, le 3^rd la principale cause de cancer liés aux Etats-Unis²⁴, comme un exemple et un modèle, une méthode rapide et cohérente a été développée pour croître et dosage des sphéroïdes 3D à l’aide de la co-culture de cellules de cancer du pancréas et activer les fibroblastes du pancréas. À l’aide de bioprinting magnétique, sphéroïdes allant de 400 à 600 µm de diamètre ont été obtenus. Ceux-ci ont été soumis à des épreuves métaboliques pour tester avec succès la fonctionnalité de l’élevage sphéroïdes 3D. Cette méthode est simple, cohérent et peut être facilement adaptée à d’autres types de cellules.

Bien que cette méthodologie accélérera et ajouter à la valeur translationnelle des essais effectués avec sphéroïdes 3D, il peut être amélioré en mettant au point des techniques permettant de multiplexage de manipulation sphéroïde et de manutention. Cela devrait réduire davantage le temps global, le coût et la main-d’oeuvre requise pour effectuer le test. En outre, volumes de sphéroïde peuvent être utilisées pour normaliser OCR signaux tel que rapporté par d’autres⁶. Volume de sphéroïde normalisée par le volume moyen d’une cellule pourrait être utilisée pour déterminer les OCR par cellule, mais étant donné que la croissance des sphéroïdes ne seront pas identique, pourrait être difficile de calculer un OCR absolue par cellule. Actuellement, cette méthode est limitée par le manque d’un outil efficace pour manutention de sphéroïde multiplex et transfert des plaques de croissance pour analyser l’environnement.

La méthode décrite est modifiée et adaptée de la technologie magnétique bioprinting et plus validée pour montrer la pertinence fonctionnelle en appliquant les sphéroïdes cultivées à un essai métabolique en aval. La méthode fournit un outil important pour générer des sphéroïdes robustes, viables et fonctionnels qui contiennent les deux types de cellules principales trouvées dans la plupart des tissus tumoraux, les cellules cancéreuses et les fibroblastes de cancer associé, qui peuvent être utilisés pour d’autres tests expérimentaux, tels que les écrans de la drogue. La relative facilité et l’efficacité de la méthode de NS est une amélioration majeure sur les autres méthodes²⁵, tels que la pendaison drop méthode²^,²⁶ de génération de sphéroïde.

Robustes sphéroïdes générés comme tel fournissent un modèle de tumeur in vitro qui inclut les cellules du stroma, qui manquent souvent de nombreuses études sur la culture 3D. Les possibilités d’application des modèles 3D sphéroïde généré en tant que tel sont vastes. Par exemple, ces modèles peuvent être employés pour étudier les interactions cellule-cellule, déplacements de bioénergétique et de tester la susceptibilité génétique et la dépendance à l’égard de différents schémas thérapeutiques. Sphéroïdes 3D qui récapitulent le microenvironnement de la tumeur en vivo servent d’outil très pertinent et utile pour études et ceux qui étudie les mécanismes d’action des agents thérapeutiques actuels et nouveaux de dépistage de drogue. Métaboliques essais probing voies énergétiques à l’aide de sphéroïdes cultures avec les cellules mutantes peuvent aider à jeter un nouvel éclairage sur le rôle de ces gènes et voies connexes dans la pathobiologie dans un modèle 3D pertinent du cancer, comme les sphéroïdes décrites dans la présente étude.

L’application réussie de cette méthode repose avant tout sur la santé des cellules d’impression magnétique, ce qui explique pourquoi les cellules en phase logarithmique devraient être récoltés et magnétisé. Il est essentiel d’utiliser le lecteur magnétique sphéroïde pour imprimer des cellules magnétisées et pas le lecteur d’exploitation, qui devrait être utilisé uniquement pendant le lavage sphéroïde et médias reconstituer les étapes de la méthode décrite. Autre aspect le plus important pour la lecture avec succès des tests métaboliques est de maintenir la morphologie des sphéroïdes lors du transfert de la plaque de croissance de la plaque de test.

Dans l’ensemble, ce protocole a été établi pour la génération des sphéroïdes 3D qui contiennent des cancers et des cellules stromales, après l’essai métabolique ultérieure des sphéroïdes à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. Les principales caractéristiques de cette méthode sont qu’il est rapide, facilement adaptables et cohérentes et pertinentes à et imite le microenvironnement de tumeurs in vivo , est relativement peu coûteux et peut servir comme un nouvel outil pour étudier la biologie tumorale et développer des anticancéreux agents.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Samuel Zirbel aide à optimiser les conditions de culture et au suivi de croissance sphéroïde. Nous sommes reconnaissants à Agilent technologies permettant l’analyseur^e96 SeaHorse XF, réactifs de dosage et connaissances techniques. Nous remercions également m. Hemant Kocher Barth Cancer Institute au Royaume-Uni pour fournir les cellules de la PS1. Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation Magowitz de Seena pour la recherche sur le Cancer du pancréas et un Stand jusqu’au Cancer-Cancer Research UK-Lustgarten Foundation pancréatique Cancer Dream recherche subvention d’équipe (Grant Number : SU2C-AACR-DT-20-16). Stand Up To Cancer est un programme de la Fondation de l’industrie du divertissement. Subventions de recherche sont administrées par l’American Association for Cancer Research, le partenaire scientifique de SU2C.

Materials

0.05% Trypsin EDTA	Sigma	25300-054
96 well cell repellant plate	USA Scientific/ Griener Bio-One	655970	spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
D-Glucose	Sigma	D9434
DPBS	Gibco	14190-144
Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
L-Glutamine	Sigma	59202C
Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent Technologies	103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C
Patu8902 cells	Laboratory Stock		pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells	Laboratory Stock		activated pancreatic stellate cells
RPMI1640	Gibco	11875-093	growth media for cells, spheroids
SeaHorse XF^e96 extracellular flux analyzer	Agilent Technologies		extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636
XF Base media	Agilent Technologies	102365-100	base media for metabolic assays on XF^e96

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3D Spheroid Co-culture Pancreatic Cancer Cells Fibroblasts Metabolic Assay Extracellular Flux Analysis Tumor Microenvironment Cell Magnetization Nanoshuttle Magnetic Spheroid Drive

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Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).