Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Pawan Noel; Ruben Mu&#241;oz; George W. Rogers; Andrew Neilson; Daniel D. Von Hoff; Haiyong Han

doi:10.3791/56081

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Kanser Araştırmaları

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Published: August 23, 2017

doi:

10.3791/56081

Pawan Noel¹, Ruben Muñoz¹, George W. Rogers², Andrew Neilson², Daniel D. Von Hoff¹, Haiyong Han¹

¹Molecular Medicine Division,Translational Genomics Research Institute, ²Agilent Technologies

Özet

Burada, pankreas kanseri hücreleri ve metabolik fonksiyonların bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak ölçüm tarafından takip fibroblastlar, 3 boyutlu (3D) küresel ortak kültür hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır.

Abstract

Pankreas kanseri, dahil olmak üzere birçok kanser türü tümör ilerleme ve işgali önemli bir rol oynamaktadır yoğun fibrotik stroma var. Aktif kanser ilişkili fibroblastlar kanser hücreleri ile etkileşim ve onların büyüme ve hayatta kalma destekleyen tümör stroma önemli bir bileşeni vardır. Kanser hücreleri arasındaki etkileşimin özetlemek ve fibroblastlar aktif modelleri önemli antitümör ajanlar gelişimi ve stromal biyoloji okuyan için araçlardır. Burada, pankreas kanseri hücreleri ve sonraki biyolojik çalışmaları için kullanılan aktif pankreas fibroblastlar sağlam 3 boyutlu (3D) küresel iş kültürünün hızlı üretimi için bir yöntemi açıklanmıştır. Ayrıca, açıklanan bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak hücresel bioenergetics yolları araştırmak için fonksiyonel metabolik deneyleri taşıyan 3D pulcuklarının kullanımı bir küresel Mikroplaka ile eşleştirilmiş. Pankreas kanseri hücreleri (Patu8902) ve aktif pankreas fibroblast hücreleri (PS1) Co kültürlü ve Biyouyumlu nanopartikül derleme kullanarak manyetik. Manyetik hücreleri hızla büyüme medya kültürünün 5-7 gün içinde 400-600 µm arasında değişen çapında pulcuklarının oluşturmak için 96 iyi kartvizitlere manyetik diskler kullanarak bioprinted vardı. Patu8902-PS1 pulcuklarının kullanarak fonksiyonel metabolik deneyleri sonra hücresel enerjik yolları araştırmak için hücre dışı akı teknolojisi kullanılarak yapılmıştır. Yöntem burada basittir, kanser hücre-fibroblast küresel ortak kültürlerin tutarlı üretimi sağlar ve potansiyel olarak diğer kanser hücre türü geçerli açıklanan metodoloji duruma getirilmesi üzerine adapte edilebilir.

Introduction

Son on yılda çok sayıda vitro 3D modelleri özetlemek ve in vivo tümör biyolojisi, microenvironment ve büyüme koşullarını kanser hücreleri¹^,²için geliştirilmiştir. İki boyutlu (2D) monolayer hücre kültür biyokimyasal faktörler ve araştırma bileşikler Tekdüzen maruz sistemleriyle yerli 3D stromal tümör etkileşimleri maruz bir degrade ekstraselüler Difüzyon bileşiklerin çoğaltmak için başarısız matris proteinler (ECM)³^,⁴. Böylece, 2B doku kültürü modelleri ile karşılaştırıldığında, modelleri daha iyi tümör microenvironment taklit potansiyel göstermek için ortaya çıktı ve daha iyi için önemli araçlar olarak hizmet 3D kanser hipoksi vivo içinde tümör niteliklerinden anlamak, desmoplasia, uyuşukluk, uyuşturucu alellerle, toksisite ve tedavi direnci⁵^,⁶. Bu amaçla, 3 boyutlu modeller hızlı üretimi ve tutarlılık için nispeten ucuz ve en iyi duruma getirilmiş olurken vivo içinde tümör özellikleri, taklit ederek 2D hücre kültürü ve bütün hayvan modelleri arasında köprü için potansiyel var. Bu avantajları translasyonel araştırma kanser biyoloji, morfogenez ve⁷^,⁸mühendislik doku dahil olmak üzere birçok alanda hızlandırmak için istismar değildir.

3D doku kültürü yöntemleri gelişen bir dalgalanma içinde manyetik levitation teknikleri son zamanlarda geliştirilmiş ve büyüme için açıklanan, raporlaması ve pulcuklarının Imaging çeşitli hücre türleri⁹^,¹⁰‘ dan^, elde edilen ¹¹ ^, ¹². manyetik 3D bioprinting yararlanan manyetik Biyouyumlu nano tanecikleri hücrelerle magnetizing ve bunları çok iyi formatlarında yazdırırken doku Mühendisi için güçlerini kullan. Bu tutarlı, hangi harnessed ve biyokimya ve biyofizik soruşturma¹⁰aşağı akım uygulamalarda bir bolluk için istihdam aynı 3D pulcuklarının yakınındaki hızlı üretim sağlar. Burada demir oksit, Poli L-lizin ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar etiketlemek için altın nano parçacıklar denilen Nanoshuttle (NS) oluşan bir Biyouyumlu malzeme kullanarak manyetik bioprinting tekniği adapte olması. NS verdiği Elektrostatik plazma zarı için herhangi bir belirli reseptörleri bağlamak için bilinen değil ve bir hafta içinde bültenleri kapalı hücre yüzey. Çok düşük manyetik kuvvetler (30pN) gerektirir, toplamak ama değil zarar için yeterli hücreleri ve hücre canlılığı, metabolizma veya 3D kültürler¹⁰^,¹³^,^{14 için son derece Biyouyumlu yapmak için üretimi etkilemez} ^,¹⁵.

Bu çalışmada, pankreas kanseri bir örnek ve model kullanarak oluşturma ve 3D kanser hücre-fibroblast pulcuklarının metabolik tahlil tarif biz. 2D damarlarının kültürlü hücre başlayarak, pankreas tümörü-fibroblast ortak kültür pulcuklarının manyetik bioprinting kullanarak kültür ve büyüme koşullarını göstermektedir. Bir teknoloji aynı anda ölçmek için iki büyük enerji üreten yolları, Glikoliz ve canlı çeşitli mitokondrial solunum gösterdi, kültürlü pulcuklarının sonra bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak fonksiyonel metabolik deneyleri içinde kullanıldı hücre ve dokuların¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Mitokondrial solunum veya oksidatif fosforilasyon ölçüldü iken Glikoliz oksijen tüketim hızı (OCR) olarak ekstrasellüler asitleştirme oranı (D.H.T.), bir değişiklik olarak ölçüldü. Önerdiğimiz pankreas tümörü pulcuklarının için geliştirilen bu yöntem en iyi duruma getirme ve 3D tümör küresel üretimi ve diğer hücre/doku türlerine tahlil çeviri için bir omurga olarak hizmet verebilir.

Protocol

1. pankreas kanseri kültür 3D pulcuklarının manyetik Bioprinting kullanarak kullanarak standart aseptik doku kültürü tekniği, kültür hücreleri bir T75 şişesi bir confluency uygun büyüme medya % 70-80 için ilgi. Not: Genellikle, bir % 70-80 Konfluent T75 şişesi 5-7 × 10 6 hücre hasat edildi. Bu çalışmada – Patu8902 kullanılan iki farklı hücre türleri (pankreas tümörü hücreleri) ve PS1 hücreleri (aktif pankreas Yildiz Seklinde hücreleri 21). Her iki hücre hatları Roswell Park Memorial Enstitüsü medya % 10 (v/v) fetal sığır serum(FBS) ile 1 × penisilin-streptomisin (p/s) takıma 1640 (RPMI-1640) kültürlü. Yıkama bir kez 5 mL Dulbecco de içeren hücreleri ' s fosfat tamponlu saline(DPBS). Ayır hücreleri plastik yüzey 2 mL % 0.05 ile trypsinizing tarafından tripsin-EDTA 5-10 dk 37 ° C. onay mikroskopla hücre dekolmanı için. Devre dışı bırak tripsin tarafından 8 mL büyüme ortamına ilavesi hücreleri ilişkisi kesildi. Bu sağlık/hücre canlılığı olumsuz etkileyebilir gibi trypsinization üzerinde kaçının. Yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon ve sayı üretmek için damlalıklı hücreleri hücre yoğunluğu bir otomatik hücre sayaç veya bir hemasitometre kullanarak. Bu arada, NS bir şişe için ortam sıcaklığı equilibrate. Hücreler için istediğiniz sayıyı pulcuklarının (kuyu) ve aliquot yeni bir 15 mL konik tüp için tohum için gereken miktarını hesaplar. Örneğin, bir tüm 96 de plaka 5. 000 hücre/iyi, aliquot en az 5.5 × 10 5 hücreleri ile tohum için. 500 x g 3 dakika süreyle de dikkatle centrifuging tarafından toplamak hücreleri Aspire edin veya süpernatant dikkatle boşaltmak ve 1.0 x 10 6 hücre/mL büyüme medyada bir konsantrasyon hücreleri resuspend. Yavaşça kesme önlemek için geniş sıkılmış damlalıklı ucu kullanarak pipet. Örneğin, resuspend 5.5 x 10 5 hücrelerde büyüme ortamının 550 µl. Denge NS (Adım 1.6) kullanarak hücreleri istenilen miktarda manyetize. Doğrudan NS hücre süspansiyon büyüme medya ekleyin ve hafifçe kışkırtmak. Verimli manyetik hücrelerinin etiketleme için 100 µL hücreleri (1 x 10 6 hücre/mL resuspended) başına 10 µL NS kullanın. Not: tipik bir deneme için etiket 5.5 × 10 5 Patu8902 55 µL NS ve 1.1 × 10 ile 550 µL yılında 1100 µL, hücrelerde 6 PS1 (ayrı ayrı) 110 µL NS ile hücreleri. Hücre süspansiyon sağlamak için yavaşça ters çevir’i tüp bir kaç kez. Geçici olarak, hücre-NS mix 24-şey plaka tek bir kuyunun içine aktarın. Mıknatıslı olmalı ayrı ayrı her hücre türü için bunu. Plaka kapak ve hücreleri hücre yüzeyine NS bağlamaya izin vermek için nazik sallayarak ile 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: Hücre kültürü ve herhangi Patu8902 veya hücreden PS1 tek başına, her ikisi ile başlayan ortak kültür pulcuklarının yanı sıra başlamadan pulcuklarının testin manyetik diskler üzerine baskı başarıyla bağımsız bu yöntemi kullanarak elde önce premix türleri deneyler. Ortak kültür pulcuklarının Patu8902 ve PS2 hücreleri oluşturmak için bir yöntem sonraki adımlar aşağıda anlatılan. Damlalıklı manyetik hücreleri yukarı ve aşağı yavaşça eşit olarak mix ve istenen cep numarasını içeren bir ana karışım hazırlamak için. Pulcuklarının tohum, toplam 15.000 hücre (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) kullanın ve iyi bir 96-şey plaka başına 150 µL toplam hacmini küçültme/büyütme. Not: her kuyuya reçete son hacim kullanılan hücre sayısından bağımsız olarak aynı olması gerekir. Bir hücre kovucu 96-şey plaka 96-şey manyetik küresel sürücü üstüne yerleştirin ve her kuyuya hücre karışımı 150 µL dağıtmak. Hücrelerin yavaş yavaş toplamak oldukça üzerinde mıknatıs ortasına gözlemlemek. Kapak ve 37 ° C’de hâlâ bağlı manyetik küresel sürücüyle ayarla gecede bir % 5 CO 2 kuluçka plaka kuluçkaya. Manyetik sürücü kaldırmak ve daha fazla büyüme için 7 gün için kuluçkaya. Not: Hücre kovucu büyüme plakaları manyetik küresel sürücüsü kullanarak küresel yazdırmada kullanmak için önemlidir. Daha ince daha küçük mıknatıslar küresel sürücüyle kullanılmasını sağlamak holding sürücü dahil değil. Her gün pulcuklarının büyümesini izlemek. Manyetik sürücü bir açıyla tutarak ve harcanan medya çizmek için bir çok kanallı damlalıklı kullanarak monte büyüme plaka yerleştirerek üç günde taze büyüme medya ile doldurmak. Not: 15.000 hücreler/kuyuda co tohumlari Patu8902 ve PS1 hücreleri 5-7 gün içinde 400-600 µm büyüklüğündeki 3D pulcuklarının içine büyüyecek. Bu noktada pulcuklarının metabolik karakterizasyonu, uyuşturucu değerlendirme ve aşağı akım diğer uygulamalar için hazır değil. 2. 3D pankreas tümörü pulcuklarının metabolik tahlil Bioenergetics ekstrasellüler akı Çözümleyicisi’ni kullanarak yolları için Not: Bu bölümde, bir hücre dışı akı kullanarak pulcuklarının metabolik fonksiyonların analizi 3D pulcuklarının için özel olarak tasarlanmış tahlil Mikroplaka analizörü açıklanmıştır. Yıkama ve Mikroplaka tahlil transferi pulcuklarının büyüme plakalar üzerinden küresel. Not: ~ 500 µm çapı ulaştığınızda pulcuklarının metabolik testleri için kullanılabilir. Tahlil gerçekleştirmeden önce gün tahlil calibrant (200 µL/de) sağlanan yarar plaka sonda veya sensör kartuşla hidrat ve kuluçkaya 37, ayarla geceleme (4-18 h) oksijen kuluçka (non-CO 2) ° c Hazırlamak uygun tahlil orta istenen metabolik tahlil için (bkz: malzemeler tablo) temel medya ilave tarafından her iki 2 mM L-glutamin Glikoliz stres testi (GST) için tahlil veya 1 mM pyruvate, 2 mM L-glutamin ve 10 mM ile glikoz için bir Mitokondrial stres testi (MST) tahlil. Not: Hücre dışı akı analyzer mitokondrial solunum (OCR) ve Glikoliz (D.H.T.) bir 96-şey plaka biçimde canlı hücrelerin ölçer. Bu oranlar hücresel metabolik fonksiyon soruşturma altında yapılan genel bir bakış sağlar. İçin ayrıntılı talimatlar için tahlil kitleri kılavuzuna başvurun. Ekleme tahlil sonra özel takviyeleri (bakın adım 2.1.1), 37 ° C su banyosu desteklenmiştir tahlil ortamda sıcak ve pH 7.4 ± 0,1 0.1N ile ayarlamak NaOH. Orta kadar kullanmak sıcak tutmak. Yeniden oluşturmak tahlil kiti reaktifler kalibre tahlil orta önerilen hisse senedi konsantrasyonları. Not: Bunlar 10 × wells istenen son konsantrasyonu yapılır. Glikoz, oligomycin ve 2-Deoksi-glikoz (2-DG) hisse senedi konsantrasyonları 100 mM, 100 µM ve 500 mM, sırasıyla vardır. Küresel morfoloji ve genel bütünlüğü için; şekil ve structur açısından kontrol etmek için gözlemlemek pulcuklarının büyüme plaka bir ışık altında mikroskope pulcuklarının. Manyetik holding arabayla büyüme tabağa aktarın ve dikkatle ~ 120 µL büyüme medya Aspire edin. Yavaşça pulcuklarının ~ 120 µL ısıtılmış ve önceden kalibre tahlil medya ile yıkayın, Aspire edin ve yıkama iki kez tekrarlayın. Pulcuklarının tekrar pulcuklarının uzakta yıkanır değil olduğunu emin olmak için mikroskop altında incelemek. Her şey için 180 µL sıcak tahlil medya ekleyerek küresel tahlil Mikroplaka hazırlayın. İçin 10 µL P20 micropipette ayarla ve geniş sıkılmış bir ucu uygun. Geniş sıkılmış ipuçları mevcut değilse, bir temiz makas veya delik genişletmek için neşter ile düzenli pipet ipuçları bahşişlerden kesti. Not: Bu kesme azaltmak ve plakaları tahlil için transfer ederken pulcuklarının genel morfolojisi korumak. Sıcak (37 ° C) yüzey pulcuklarının transferini taşımak için kullanın. Kontrastı Artır ve pulcuklarının görselleştirme aktarım işlemi sırasında yardım için bir beyaz ışık lamba ile sıcak bir röntgen film Görüntüleyici yüzey kullanın. Dikkatle tek bir önceden yıkanmış küresel P20 micropipette kullanarak hücre kovucu büyüme plaka geniş bir ile donatılmış aspiratı uç ve yavaşça transfer küresel doğrudan içine her şey metabolik taşımak için bir küresel tahlil kalıbının ortasına delik tahlil. Yavaşça tahlil plaka doldurmak için saf yerçekimi tarafından Merkezi mikro-odanın içine her şey düşmeye her küresel izin. Not: Genellikle 5-8 s her küresel yerçekimi tarafından iyi Merkezi düşmek için alır. Mikro odasında pulcuklarının yerleşti kadar pipet çekmeyin. Yapmak değil para yatırma pulcuklarının bunlar beri tahlil plaka (A1, A12, H1, H12) 4 köşe Wells kullanılacak arka plan wells. Morfoloji ve her küresel her şey ortasında olduğundan emin olmak için her küresel konumunu izlemek. Gerekirse, delik tarafından geniş bir yelpazede kullanarak küresel alıyorum iyi ortasına yeniden konumlandırmak damlalıklı ipucu ve sonraki ifade yerçekimi tarafından. Tüm pulcuklarının transfer kez tahlil plaka 37 ° C oksijen hava kuluçka (CO 2) bir saat öncesinde tahlil yerleştirin. Bileşikler ve tahlil gerçekleştirme sensör kartuşla yükleme hazırla 10 × 2.1.2. adımda anlatılan tahlil belirli medya tahlil belirli reaktifler yoğunlaşmıştır. Örneğin, glikoz, oligomycin ve 2-DG önerilen miktarlar sulandırmak, GST taşımak için tahlil manuel olarak anılacaktır. GST ve MST deneyleri yürütülen Patu8902-PS1 pulcuklarının kullanarak. Düzgün sensör kartuş ile A-H sol tarafta etiketli satır yönlendirmek ve bir yükleme Kılavuzu sensör kartuş üstüne yerleştirin. İstenen bağlantı noktasının doğru yükleme yüklenecek bağlantı noktasına karşılık gelen mektubu vasıl belgili tanımlık üst sol köşe böylece Yükleme Kılavuzu yönlendirme sağlamak. Doğrudan enjeksiyon noktalarına dağıtmak reaktifler kullanarak bir çok kanallı pipet. Yükleme kılavuzları parmak boyunca yordamı kullanarak pozisyonda tutun. Not: Her reaktif tahlil manuel olarak anılacaktır önerilen Port eklenecek. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının ama hava kabarcıkları kaldırmak için kartuş herhangi bir bölümünü dokunun değil. Kaldır Yükleme Kılavuzu ve konumuna göz hizasında kartuş ile bile yüklemek için enjeksiyon bağlantı noktaları kontrol edin. Enstrüman denetleyicisi dalga yazılım (bundan böyle, analiz yazılımı) 2.3 bölümünde açıklandığı gibi deneysel tahlil tasarım/enstrüman iletişim kuralı’nı oluşturun. Tahlil tasarım ve analiz yazılımı kullanılarak yürütme deneme için bir tahlil şablonu oluşturma analiz yazılımı açın ve’ı tıklatın " Şablonlar " veya varolan bir tahlil seçin Şablon. Çift tıkırtı üstünde " boş şablon ". Tanımla deneysel grupları ve koşullar. Define enjeksiyon stratejileri A, B ve C. bırak bağlantı noktaları için bağlantı noktası D boş. Not: GST tahlil için yalnızca bu bağlantı noktalarını glikoz, Oligomycin ve 2-DG ile yüklenir. MST tahlil durumunda, oligomycin, FCCP ve rotenon yüklenmiş olacak. Pulcuklarının bir veya daha fazla test bileşikler ve kontrol grubu ile tedavi edildi Eğer tanımla öncesi tedaviler. Kaynak, ek ve diğer bilgileri içerecek şekilde tahlil medya tanımlayın. Yoğunluğu ve geçiş numarası bilgilerini görmek bir veya daha fazla hücre tipi (örneğin Patu8902, PS1) tanımlayın. ‘I tıklatın " grupları oluşturur ". ‘I tıklatın " plaka harita " tab ve deneysel tasarım karşılık gelen tahlil plaka grupları atama. Dört köşe wells arka plan wells seçin. Bu wells için yapılan hiçbir pulcuklarının olduğundan emin olun. Tahlil Çözümleyicisi çalıştırmak alet protokol sekmesini tıklayın devam et varsayılan protokol komutları kontrol ederek " Ayarla’ya ", " Equilibrate " ve " temel ölçüm döngüsü ". Tıklama " enjeksiyon " ve her bağlantı noktası için bileşik tanımlayın. Ölçüm devir 6 döngüleri için varsayılandan pulcuklarının için 3 kür düzenleyin. Varsayılan 3 min mix, 0 dk bekle ve 3 dak ölçü kez devam. Not: Varsayılan mix-bekle-ölçü kez 3 dk, 0 dk, 3 dk, sırasıyla vardır. Üç Bazal oranı ölçümleri genellikle ilk tahlil bileşik enjeksiyon önce alınır. Bu ölçümler kalibre edilmiş ve başı olarak deneysel tasarım ayarlamalara gidilmesi. Protokolü ve grubu Özeti gözden geçirin. Tahlil Tasarım Şablonu Kaydet. Enjeksiyon bağlantı noktalarını tahlil yüzeyler ile yüklenen sonra öncesi tahlil kalibrasyon için devam edin. Yardımcı program plaka kartuşla ekstraselüler akı Çözümleyicisi’transfer. Not: Bu genellikle 15-20 dk içinde tamamlar ve OCR ve D.H.T. ölçümleri yapmak için sensörler kalibre. Kartuş kalibrasyonu sonra yardımcı programı plaka 3D pulcuklarının içeren önceden ısıtılmış tahlil plaka ile değiştirin ve tahlil başlatmak. Ölçümler tamamlandıktan sonra verileri elektronik tablo veya grafik ve istatistiksel yazılım verileri çözümlemek için verin.

Representative Results

Manyetik bioprinting ve 3D pulcuklarının ekstraselüler akı analizi için genel iş akışı Şekil 1 bu protokol için açıklanan tüm işlemine genel bakış gösteriyor. Pankreas kanseri hücreleri (Patu8902) ve aktif Yildiz Seklinde hücreleri (PS1) % 70-80 confluency için uygun büyüme ortamı içeren doku kültürü şişeler içinde kültürlü. Hücreleri 2D kültür gemiden ayrılmış ve yıkanmış, hücre yoğunluğu tespit edildi ve son olarak 1 × 106 hücre/mL, büyüme medyada resuspended hücreleri. NS, altın, demir oksit ve poli-L-lizin oluşan bir nanopartikül derleme hücreleri manyetize için kullanıldı. Tek tek manyetik Patu8902 ve PS1 hücreleri sonra karışık ve bir manyetik küresel sürücüde takılı 96-şey hücre kovucu büyüme plakalar üzerine yazdırılır. Hücreleri tek şey (5000 Patu8902 hücreleri tek bir küresel oluşturmak için 10.000 PS1 hücreleri ile karışık) tohum için toplam sayısı olarak 15.000 optimize. 5-7 gün için uygun doku kültürü koşullar altında kuluçka sonra 3 boyutlu pulcuklarının, hangi süre içinde bu pulcuklarının büyümesi izlenen ve kaydedilen elde edilmiştir. Tahlil medya ile yıkadıktan sonra pulcuklarının fiziksel olarak metabolik deneyleri Glikoliz ve mitokondrial solunum eş zamanlı ölçüm için bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak yürütmek için bir küresel Mikroplaka üzerine transfer edildi. Kültür ve pankreas tümörü-fibroblast pulcuklarının gelişmesiFonksiyonel ve sağlam pulcuklarının elde etmek için epitel kanser hücresi Patu8902 hat ve Yildiz Seklinde hücre PS1 kültürlü RPMI-1640 fetal sığır serum ile desteklenmiş içinde harekete geçirmek. Pat8902 ve NS ile manyetik PS1 hücreleri sonra birlikte bir oranı 1:2, böylece için iyi bir büyüme plaka başına 15.000 hücre toplam tohum karıştırıldı. Manyetik sürücülere hücreleri yazdırma 24 h içinde hücreleri de merkeze focalized tam olarak üst kısmında her manyetik PIN altında her şey. Patu8902-PS1 pulcuklarının büyüme yanında düşsel günlerde 2, 4, 7 ve 9 hücreleri tohum sonra takip. Şekil 2 çeşitli zaman noktalarda yukarıdaki miktar temsilcisi pulcuklarının ortalama çapı gösterir. Pulcuklarının çapı 2 günde 7 596 µm için baskı sonrası günde 414 µm artırır. Büyüme gün 7 ve 9 arasında anlamlı bir fark vardı ve böylece daha fazla deneme için 7 gün küresel büyüme sınırlıydı. Özellikle dış kenarları daha keskin bir Morfoloji pulcuklarının kazanmak ve NS giderek daha eşit bir şekilde küresel hacmi gün kültür ile dağınık fark ettim. Biz de onların birincil ve ikincil eksenleri uzunluğuna göre 10 pulcuklarının küresellik tahmin. Ortalama küresellik 0,92 ± 0,04 Patu8902 yalnız (tümör) için 0.95 ± 0,04 PS1 (stromal) yalnız ve 0,94 ± 0,02 için ortak kültür pulcuklarının için var. Pankreas 3D pulcuklarının kullanarak fonksiyonel metabolik tahlil hücre dışı akı ÇözümleyicisiPulcuklarının işlevselliğini sınamak için metabolik istihdam ve enerji yolları pulcuklarının içinde soruşturma için bioenergetics analizi. Biz yukarıda açıklandığı gibi kültürlü pulcuklarının Glikoliz stres testinde yürüttü. Bu amaçla, bu iki hücre tiplerinin ortak kültüründen kaynaklanan ek olarak Patu8902 veya PS1 hücreden oluşturulan pulcuklarının için tahlil tabi tutuldu. İlginçtir, pulcuklarının, üç tür GST tahlil biyolojik olarak işlevsel bir yanıt olup olmadığını ayrı veya karışık hücrelerden kaynaklanan sergiledi. Glikoz doyurarak bir konsantrasyon enjekte üzerine pulcuklarının türleri Haritayı artar glycolytic yolu olarak D.H.T. (şekil 3) bir artış kanıtladığı test. Mitokondriyal ATP üretimi oligomycin kullanarak inhibe zaman, enerji üretim Glikoliz için vardiya ve maksimal glycolytic kapasitesi, D.H.T. daha fazla artış olarak görülen hücreleri itti. 2-DG, rekabetçi glikoz hexokinase, D.H.T., D.H.T. önceki artış glycolytic etkinliği nedeniyle olduğunu onaylayan bir azalma sonucunda bağlayan bir glikoz analog kullanarak Glikoliz inhibisyonu. PS1 yalnız pulcuklarının (ortalama çapı 250 µm) muhtemelen daha küçük boyutu ve Patu8902 kanseri ile karşılaştırıldığında daha düşük glycolytic kapasite nedeniyle nispeten daha düşük bir sinyal olmasına rağmen biz fark bu çalışmada test pulcuklarının bu şekilde cevap verdi hücreleri (ortalama çapı 600 µm). Genel olarak, daha yüksek bir D.H.T. sinyal tümör hücreden elde edilen bu oranla asgarî PS1 fibroblast karşılaştırıldığında pulcuklarının pulcuklarının türetilmiş, muhtemelen kanser hücrelerinin doğru Glikoliz22’deki doğal metabolik eğim atfedilen olabilir, 23. Her ne kadar biz küresel boyut değişimi her türüyle PS1 yalnız pulcuklarının en küçük varlık arasında ortak kültür pulcuklarının tarafından takip fark pulcuklarının üç tür aynı sayıda hücre, tohum elde edilmiştir ve Patu8902 yalnız pulcuklarının olmak en büyük. Mitokondriyal işlev içinde 3D pulcuklarının test etmek için biz ortak kültür pulcuklarının MST tahlil için tabi. MST mitokondriyal işlev anahtar parametreleri doğrudan hücre (şekil 4A ve 4B) OCR ölçerek ölçer. Bileşikler (oligomycin, FCCP ve karışımı rotenon ve antimycin A) ile seri bir enjeksiyon gibi ATP üretimi, maksimal solunum ve sigara mitokondrial solunum anahtar mitokondrial parametreleri ölçmek için kullanıldı. Bu parametreleri ve Bazal solunum oranları daha da proton sızıntı ve yedek solunum kapasitesi (şekil 4 c) hesaplamak için kullanılmıştır. OCR azalma oligomycin yanıt olarak bir inhibitörü olan ATP sentaz (karmaşık V) hücresel ATP üretimle ilişkili mitokondrial solunum belirtilirler. Pulcuklarının maksimal penetrasyon ve etkili tepki süresi sağlamak daha uzun bir süre için oligomycin ile inkübe. İkinci bir enjeksiyon uncoupler FCCP ile maksimal oksijen tüketimi ve OCR karşılık gelen bir artış uyarır. FCCP uyarılmış OCR yedek solunum kapasitesi, hücre artan enerji talebi için tepki yeteneğini bir ölçüsü hesaplamak için kullanıldı. Üçüncü enjeksiyon; rotenon, karışımı bir (bir kompleks ben inhibitörü) ve antimycin A (karmaşık III inhibitörü) OCR (şekil 4B keskin bir düşüş olarak görülen mitokondrial solunumu engellerOng >). Genel olarak, bizim gözlemler yukarıda açıklandığı gibi metabolik ayak izi/faaliyetlerini her iki glycolytic ve mitokondrial potansiyeli açısından bir ölçüsü olarak bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak kültürlü pulcuklarının işlevselliğini doğrulayın. Resim 1 . Kültür ve pankreas kanseri hücreleri/fibroblast pulcuklarının testin metodolojisi şematik gösterim. Patu8902 ve PS1cells kültürlü, trypsinized, yıkanmış sayılır ve vardı. Her küresel Patu8902 tohum için (5. 000 hücre/de) ve PS1 fibroblastlar (10.000 hücre/de) manyetik NS kullanarak ve 1 gün bir hücre kovucu büyüme plaka üzerinde basılı. Tohum sonra büyüme plaka (olan bir mıknatıs her şey 96 iyi biçim büyüme plaka altında) bir manyetik küresel sürücü monte ve kültür 2-7 gün 3D pulcuklarının elde etmek izin. Elde edilen pulcuklarının yıkanmış ve ekstraselüler akı cihazda metabolik testleri yürütmek için küresel tahlil Mikroplaka aktarılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 . Pankreas tümörü-fibroblast pulcuklarının büyüme. (A) Patu8902-PS1 ortak kültür küresel kültür güne karşılık gelen temsilcisi bir görüntüsünü üstte görünen ve boyutu (µm) küresel çapı aşağıda sayılabilir. Küresel boyutu ve Difüzyon hacmi boyunca (karanlık nokta) NS parçacıkların ilerici artış 2 ve 7 gün arasında belirgindir. Pulcuklarının kültüründe bir ek 2 küresel çapı önemli bir artışa neden gün, bundan sonra tutuldu. (B) temsilcisi tümör hücreleri (Patu8902), stroma hücreleri (PS1) ve co kültürlü hücreleri (Patu8902 + PS1) türetilmiş pulcuklarının resimlerini gösterilir. (C) küresellik veri–dan her gruptan 10 bireysel pulcuklarının tasvir edilir. Hata çubukları standart sapma (SD) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 . Glikoliz stres testi (GST) ile pankreas pulcuklarının. (A) tipik glycolytic işlevi tahlil tasvir çeşitli tahlil parametrelerle şematik gösterimi. (B) bir GST test örneği açıklanan yöntemi kullanarak kültürlü pankreas pulcuklarının üzerinde gerçekleştirilen. Glikoz enjeksiyon rampa yukarı Glikoliz D.H.T., bir artış ile mitokondrial solunum kapatmaya oligomycin eklenmesi üzerinde fazla artış olarak görülmektedir. D.H.T. yanıt-e doğru 2-DG, glikoz, rekabetçi bir analog Glikoliz engelleyerek düşüyor. Tüm pulcuklarının GST tahlil için işlevsel bir yanıt sergilemek belirtilmiştir. (C) bir çıktı üç büyük parametre GST testin tasvir üreticinin Rapor Oluşturucu’yu kullanmamanızı GST testin. Hata çubukları standart hata değerlerin ortalamasının (SEM) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4. Mitokondrial stres testi (MST) ile Patu8902-PS1 pulcuklarının. (A) şematik gösterim tipik mitokondriyal işlev testin çeşitli tahlil parametreleri ile tasvir edilir. (B) pankreas tümörü-fibroblast pulcuklarının bir MST bir örneği gösterilir. (C) ortak kültür 3D pulcuklarının MST tahlil için işlevsel bir yanıt sergi. Ne zaman pulcuklarının oligomycin ile bir ATP sentaz inhibitörü meydan beklendiği gibi mitokondriyal işlev OCR bir düşüş olarak ölçülen fark edildi. FCCP elektron akışı Rampayı kullanarak hemen mitokondrial solunum kullanmanın inhibisyon çöktü maksimal OCR sonuçlandı – kokteyl mitokondrial karmaşık inhibitörleri. Hata çubukları standart hata değerlerin ortalamasının (SEM) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Pankreas kanseri, 3^rd kullanarak kanseri neden lider²⁴, bir örnek ve model, hızlı ve tutarlı bir yöntem geliştirilmiştir büyümeye ve pankreas kanseri hücrelerinin ortak kültür kullanarak 3D pulcuklarının tahlil Amerika Birleşik Devletleri’nde ölümler ve pankreas fibroblastlar aktif. Manyetik bioprinting kullanarak, 400-600 µm çapında büyüklükleri arasında değişen pulcuklarının elde edilmiştir. Bunlar başarıyla kültürlü 3D pulcuklarının işlevselliğini sınamak için metabolik testleri için tabi tutuldu. Bu yöntem basit, tutarlı ve diğer hücre tipleri kolayca adapte edilebilir.

Bu metodoloji hızlandırmak ve 3D pulcuklarının ile gerçekleştirilen deneyleri translasyonel değerini ekleyin iken, küresel manipülasyon çoğullama ve işleme sağlar teknikleri geliştirerek geliştirilebilir. Bu daha fazla mal genel zaman ve emek tahlil taşımak için gerekli azaltmak gerekir. Ayrıca, küresel birimleri olarak başkaları tarafından⁶rapor OCR sinyalleri normalleştirmek için kullanılabilir. Ortalama bir hücre hacmine göre normalleştirilmiş küresel birim hücre başına OCR belirlemek için kullanılan ama bu yana pulcuklarının büyüme aynı olmayacak, hücre başına mutlak bir OCR hesaplanması zor olabilir. Şu anda, bu metodoloji ortamı tahlil için büyüme plakalar üzerinden multiplex küresel kullanım ve transfer için verimli bir araç yokluğu ile sınırlıdır.

Açıklanan yöntemi modifiye ve manyetik bioprinting teknolojisinden uyarlanmış ve daha fazla bir aşağı akım metabolik tahlil kültürlü pulcuklarının uygulayarak fonksiyonel alaka göstermek için doğrulanmış. Yöntem çoğu tümör doku, kanser hücreleri ve diğer araştırma deneyleri için istihdam ilişkili kanser fibroblastlar bulunan iki büyük hücre tipleri içeren sağlam, kalıcı ve fonksiyonel pulcuklarının oluşturmak için önemli bir araç sağlar, uyuşturucu ekranlar gibi. Göreli kolaylık ve verimlilik NS metodolojisi olduğunu önemli bir gelişme diğer yöntemleri²⁵, asılı bırak yöntemi²^,²⁶ küresel nesil gibi.

Sağlam pulcuklarının gibi oluşturulan çoğu kez birçok 3D kültür çalışmalardan eksik stromal hücreler içeren bir vitro tümör modeli sağlar. 3B Küresel modelleri gibi üretilen uygulanması için olasılık büyük vardır. Örneğin, modelleri gibi hücre-hücre etkileşimleri, bioenergetics vardiya araştırmaya ve genetik yatkınlık ve çeşitli tedavi rejimleri bağımlılığı test etmek için istihdam edilebilir. Vivo tümör microenvironment özetlemek 3D pulcuklarının tarama çalışmaları ve bu eylem geçerli ve yeni tedavi mekanizmaları araştıran uyuşturucu için son derece alakalı ve yararlı araç olarak hizmet vermektedir. Metabolik deneyleri pulcuklarının kültürler mutasyona uğramış hücrelerle Bu genler ve ilgili yollar pathobiology, kanser, ilgili bir 3D modeli rolü içine yeni ışık tutacak yardımcı olabilir kullanarak enerji yolları sondalama bu çalışmada açıklanan pulcuklarının severim.

Bu yöntem başarılı uygulama her şeyden önce neden logaritmik faz büyüyen hücre hasat ve manyetik manyetik yazdırma için gerekli hücre Sağlık kullanır. Manyetik hücreleri ve değil sadece küresel çamaşır ve açıklanan yöntemi adımlardan Yenileyici medya sırasında kullanılan holding sürücü yazdırmak için manyetik küresel sürücü kullanmak için önemlidir. Metabolik deneyleri başarılı okuma için en kritik yandan tahlil plaka büyüme plaka aktarım işlemi sırasında pulcuklarının morfolojisi muhafaza etmektir.

Genel olarak, bu iletişim kuralı için kanser ve stromal hücreler, hücre dışı akı Çözümleyicisi’ni kullanarak pulcuklarının sonraki metabolik tahlil takip içeren 3D pulcuklarının nesil kurmuştur. Bu hızlı, kolay uyarlanabilir ve tutarlı, ilgili ve in vivo tümör microenvironment taklit eden, nispeten ucuzdur ve tümör biyoloji okuyan ve geliştirmek için yeni bir araç olarak antikanser hizmet ki bu yöntem temel özellikleri şunlardır ajanlar.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Samuel Zirbel kültür koşulları en iyi duruma getirme ve küresel büyüme izleme konusunda yardım için teşekkür etmek istiyorum. SeaHorse XF^e96 analyzer, tahlil reaktifler ve teknik bilgileri sağlamak için AGILENT teknolojileri için sana şükrediyoruz. Biz de Dr Hemant Kocher Barts Kanser Enstitüsü Birleşik Krallık’taki PS1 hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen pankreas kanser araştırma ve bir Stand Up için kanseri-kanser araştırma UK-Lustgarten Vakfı pankreas kanser rüya takım araştırma hibe için gördüğünü Magowitz Vakfı tarafından desteklenmiştir (Grant numarası: SU2C-Anti-DT-20-16). Stand Up için kanser Eğlence Sanayii Vakfı bir programdır. Araştırma hibe için kanser araştırmaları, SU2C bilimsel ortağı Amerikan Derneği tarafından yönetilir.

Materials

0.05% Trypsin EDTA	Sigma	25300-054
96 well cell repellant plate	USA Scientific/ Griener Bio-One	655970	spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
D-Glucose	Sigma	D9434
DPBS	Gibco	14190-144
Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
L-Glutamine	Sigma	59202C
Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent Technologies	103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C
Patu8902 cells	Laboratory Stock		pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells	Laboratory Stock		activated pancreatic stellate cells
RPMI1640	Gibco	11875-093	growth media for cells, spheroids
SeaHorse XF^e96 extracellular flux analyzer	Agilent Technologies		extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636
XF Base media	Agilent Technologies	102365-100	base media for metabolic assays on XF^e96

Referanslar

Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).
Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).
Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).
Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).
Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).
Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
Tseng, H., et al. . Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. , 1-9 (2015).
Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).
Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).
Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer’s molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).
Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer’s sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).
Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).

Etiketler

3D Spheroid Co-culture Pancreatic Cancer Cells Fibroblasts Metabolic Assay Extracellular Flux Analysis Tumor Microenvironment Cell Magnetization Nanoshuttle Magnetic Spheroid Drive

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).