Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Pawan Noel; Ruben Mu&#241;oz; George W. Rogers; Andrew Neilson; Daniel D. Von Hoff; Haiyong Han

doi:10.3791/56081

JoVE Journal > Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Published: August 23, 2017

doi:

10.3791/56081

Pawan Noel¹, Ruben Muñoz¹, George W. Rogers², Andrew Neilson², Daniel D. Von Hoff¹, Haiyong Han¹

¹Molecular Medicine Division,Translational Genomics Research Institute, ²Agilent Technologies

Özet

Aqui, um método é descrito para a preparação de co-cultura 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos, seguidos por medição das funções metabólicas, usando um analisador de fluxo extracelular.

Abstract

Muitos tipos de câncer, incluindo câncer de pâncreas, têm uma densa estroma fibrótica que desempenha um papel importante na progressão do tumor e invasão. Fibroblastos de câncer registrados associado são um componente-chave do estroma tumor que interagem com as células cancerosas e apoiar o seu crescimento e sobrevivência. Modelos que recapitular a interação das células cancerosas e ativado fibroblastos são ferramentas importantes para o estudo da biologia do estroma e para o desenvolvimento de agentes antitumorais. Aqui, um método é descrito para a rápida geração de co-cultura robusto 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos pancreáticos ativados que podem ser usados para estudos biológicos subsequentes. Além disso, descreveu é o uso de esferoides 3D na realização de ensaios metabólicos funcionais para sondar os caminhos de Bioenergética celular usando um analisador de fluxo extracelular emparelhado com uma esferoide microplaca. Células de câncer pancreático (Patu8902) e células de fibroblastos pancreático ativado (PS1) co foram cultivadas e magnetizado usando um conjunto de nanopartículas biocompatíveis. Magnetizada células foram rapidamente bioprinted usando unidades magnéticas em um formato bem 96, em meios de crescimento para gerar esferoides com diâmetro variando entre 400 e 600 µm no prazo de 5-7 dias de cultura. Funcionais ensaios metabólicos usando Patu8902-PS1 esferoides então foram realizados utilizando a tecnologia de fluxo extracelular para sondar vias energéticas celulares. O método aqui é simples, permite a geração consistente de câncer célula-fibroblasto esferoide co culturas e pode ser potencialmente adaptado para outros tipos de células de câncer sobre otimização da atual metodologia descrita.

Introduction

Na última década, foram desenvolvidos numerosos em vitro modelos 3D para recapitular e investigar na vivo tumor biologia microambiente condições e crescimento de células de câncer¹^,². Cultura em sistemas com uniforme exposição a fatores bioquímicos e compostos experimentais não para replicar as interações de tumor estromal 3D nativas expostas para um gradiente de difusão através do extracelular de compostos de células bidimensional monocamada (2D) matriz de³^,de proteínas (ECM)⁴. Assim, em comparação com modelos de cultura de tecidos 2D, 3D câncer modelos surgiram para melhor mostrar potencial no simulando o microambiente do tumor e serviu como ferramentas importantes para melhor compreender na vivo tumor características, tais como hipóxia, desmoplasia, letargia, penetrância drogas, toxicidade e resistência terapêutica⁵^,⁶. Para este fim, modelos 3D têm potencial para colmatar o fosso entre a cultura de pilha 2D e modelos animais toda imitando na vivo características do tumor, apesar de ser relativamente barato e otimizado para geração rápida e consistência. Estas vantagens estão a ser exploradas para acelerar a pesquisa translacional em muitas áreas, incluindo a biologia do câncer, morfogênese e tecido engenharia⁷^,⁸.

Em uma onda de evolução de métodos de cultura de tecido 3D, técnicas de levitação magnética recentemente foram desenvolvidas e descritas para o crescimento, imagem de esferoides e análise do derivado de várias células tipos⁹^,¹⁰^, ¹¹ ^, ¹². bioprinting 3D magnética explora o uso de forças magnéticas para engenheiro de tecidos por células com nanopartículas biocompatíveis de magnetização e imprimi-los em formatos múltiplos bem. Isto permite a rápida produção de consistente, perto de esferoides 3D idênticos, o que podem ser aproveitados e utilizados para uma infinidade de aplicações a jusante para investigação bioquímica e biofísica¹⁰. Aqui nós adaptamos a técnica de bioprinting magnética usando um material biocompatível, chamado Nanoshuttle (NS) composto de óxido de ferro, poli L-lisina e ouro nano partículas de rotular de fibroblastos e células de câncer pancreático. NS une eletrostaticamente a membrana plasmática, não é conhecido para vincular a qualquer receptores específicos e lançamentos fora da célula de superfície dentro de uma semana. Requer muito baixas forças magnéticas (30pN), suficiente para agregado mas não prejudicar as células e não afeta a viabilidade celular, metabolismo ou proliferação para torná-lo extremamente biocompatíveis para culturas 3D¹⁰^,¹³^,¹⁴ ^,¹⁵.

Neste estudo, usando o câncer pancreático como um exemplo e modelo, descrevemos a geração e o ensaio metabólico de esferoides de fibroblastos-células de câncer 3D. A partir de células cultivadas em vasos de 2D, ilustramos as condições de cultura e crescimento de esferoides de co-cultura de tumor pancreático-fibroblasto usando bioprinting magnético. Esferoides cultivadas foram então usados em ensaios metabólicos funcionais, usando um analisador de fluxo extracelular, uma tecnologia demonstrou a medida simultaneamente as duas vias produtoras de energia principais, a glicólise e a respiração mitocondrial, em uma variedade de ao vivo células e tecidos¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Glicólise foi medido como uma alteração na taxa de acidificação do extracelular (ECAR), enquanto a respiração mitocondrial ou fosforilação oxidativa foi medida como taxa de consumo de oxigênio (OCR). Propomos que esse método desenvolvido por esferoides de tumor pancreático pode servir como uma espinha dorsal para a otimização e traduzindo o tumor 3D esferoide geração e ensaio para outros tipos de célula/tecido.

Protocol

1. cultura de câncer pancreático esferoides 3D usando magnético Bioprinting usando padrão asséptico tecido cultura técnica, células de cultura de interesse num balão T75 para uma confluência de 70-80% em meios de crescimento adequado. Nota: Normalmente, 5-7 × 10 6 células de um frasco de T75 confluente de 70-80% foram colhidas. Dois diferentes tipos de células foram utilizados neste estudo – Patu8902 (células de tumor pancreático) e PS1 células (células estreladas do pâncreas registrados 21). As duas linhas de células foram cultivadas em meios de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) suplementado com 10% (v/v) fetal bovino serum(FBS), 1 × penicilina-estreptomicina (p/s). Lavar as células uma vez com 5 mL de Dulbecco ' saline(DPBS) de tampão de fosfato de s. Células de desanexar do plástico de superfície por trypsinizing com 2 mL de 0.05% Trypsin-EDTA para 5-10 min a 37 ° C. Check para destacamento de células sob um microscópio. Deactivate tripsina pela adição de meio de crescimento de 8 mL de desanexado células. Evite sobre tripsinização, como isto pode afetar adversamente a saúde/viabilidade de células. Células de pipeta acima e para baixo para gerar uma única célula suspensão e contagem de células densidade usando um contador automatizado de células ou um hemocytometer. Entretanto, equilibrar um frasco de NS à temperatura ambiente. Calcular a quantidade de células necessárias para semear o número desejado de esferoides (poços) e a alíquota para um novo tubo cônico de 15 mL. Por exemplo, a semente de um inteiro 96 placa bem com 5.000 células/poço, células de alíquota pelo menos 5,5 × 10 5. Coletar células por centrifugação a 500 x g durante 3 min. cuidadosamente aspirar ou decante o sobrenadante e ressuspender as células em uma concentração de 1,0 x 10 6 células/mL em meios de crescimento. Pipeta suavemente usando uma ponta da pipeta ampla entediado para evitar distorção. Por exemplo, 5,5 x 10 5 eritrócitos em 550 µ l de meio crescimento. Magnetizar a quantidade desejada de células usando o NS equilibrado (passo 1.6). Diretamente adicionar NS para a suspensão de células em meios de crescimento e agitar suavemente. Para eficiente magnético rotulação de células, use 10 µ l NS por 100 µ l células (resuspended a 1 x 10 6 células/mL). Nota: Para um experimento típico, etiqueta 5.5 × 10 5 Patu8902 células em 550 µ l com 55 µ l NS e 1,1 × 10 6 PS1 em 1100 µ l, (separadamente) com 110 µ l NS. Suavemente invertido tubo algumas vezes para garantir a suspensão de células. Temporariamente, transferi a mistura de célula-NS em um único poço de uma placa de 24. Fazer isso separadamente para cada tipo de célula a ser magnetizado. Cobrir a placa e incubar a células em temperatura ambiente por 2 h com agitação suave para permitir a ligação de NS a superfície celular. Nota: Cultura e ensaio de esferoides, começando a partir de Patu8902 ou PS1 células sozinhos, além de esferoides co-cultura, começando com os dois tipos pré-misturados antes de impressão em unidades magnéticas com êxito foi alcançado usando esse método de independente de células experimentos. Um método para gerar esferoides co-cultura de células Patu8902 e PS2 é descrito nas etapas subsequentes. Pipeta e descer as células magnetizadas delicadamente para misturar uniformemente e preparar uma mistura de mestre contendo o número do celular desejado. Para semeadura esferoides, usar um total de 15.000 células (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) e ajustar para um volume total de 150 µ l por alvéolo de uma placa de 96 poços. Nota: O volume final dispensado em cada poço deve ser o mesmo, independentemente do número de células utilizadas. Colocar uma placa de 96 poços repelente de célula no topo a unidade magnética 96 poços esferoide e dispensar 150 µ l de mistura de célula para cada poço. Observe as células lentamente recolher para o centro do poço acima do ímã. Cobrir e incubar a placa durante a noite numa incubadora 5% CO 2 conjunto a 37 ° C com a unidade magnética esferoide ainda ligada. Remova o disco magnético e incube por mais crescimento por até 7 dias. Nota: É fundamental usar placas de crescimento celular repelente para impressão de esferoide usando unidades de esferoide magnético. Certifique-se de que a unidade de esferoide com ímãs menores mais finos é usada, não a unidade de exploração. Acompanhar o crescimento de esferoides todos os dias. Reabastecer com mídia de crescimento fresco a cada três dias, colocando a placa de crescimento, montada sobre o magnético segurando o carro em um ângulo e usando uma pipeta multicanal para atrair mídia irradiada. Nota: As células Patu8902 e PS1 co semeadas em 15.000 células/poço crescerá em 3D esferoides de 400-600 µm de diâmetro dentro de 5-7 dias. Neste ponto esferoides estão prontos para caracterização metabólica, avaliação de drogas e outras aplicações a jusante. 2. Ensaio metabólico de esferoides de Tumor pancreático 3D para caminhos de bioenergética, usando o analisador de fluxo extracelular Nota: nesta seção, a análise das funções metabólicas dos esferoides utilizando-se um fluxo extracelular analisador com microplacas de ensaio especificamente projetadas para 3D esferoides é descrito. Lavagem e transferência de esferoides de placas de crescimento para esferoide ensaio microplacas. Nota: Esferoides podem ser usados para ensaios metabólicos quando atingem um diâmetro de ~ 500 µm. o dia antes de realizar o ensaio, hidrate o cartucho de sonda ou sensor com ensaio calibrant (200 µ l/poço) na placa de utilitário fornecido e incubar durante a noite (4-18 h) em uma incubadora umidificada (não-CO 2) definido em 37 ° C. Preparar o meio adequado para o ensaio metabólico desejado, completando os meios de comunicação de base (ver a tabela de materiais) com qualquer ensaio de 2 mM L-glutamina para teste de stress de glicólise (GST) ou com piruvato de 1 mM, 2 mM L-glutamina e 10mm glicose para um ensaio de teste de estresse mitocondrial (MST). Nota: O analisador de fluxo extracelular mede tanto a respiração mitocondrial (OCR) e a glicólise (ECAR) de células vivas em um formato de placa de 96 poços. Estas taxas fornecem uma visão geral das funções metabólicas celulares em amostras sob investigação. Por favor consulte o manual nos kits de ensaio para obter instruções detalhadas. Após a adição do ensaio suplementos específicos (consulte a etapa 2.1.1), aquecer o doseamento completados em banho maria a 37 ° C e ajustar o pH para 7,4 ± 0.1 com 0.1N NaOH. Aquecer o meio até uso. Reconstituir ensaio reagentes no meio de ensaio calibrado para concentrações recomendadas ações. Nota: Estes são feitos em 10 × a concentração final desejada em poços. Estoque concentrações de glicose, oligomicina e 2-deoxy-glicose (2-DG) são 100 mM, 100 µM e 500 mM, respectivamente. Observar esferoides da placa de crescimento sob uma luz de microscópio para verificar para morfologia de esferoide e uniformidade global; em termos de forma e estruturase dos esferoides. Transferência da placa de crescimento em uma unidade de exploração magnética e Aspire cuidadosamente o meio de crescimento ~ 120 µ l. Delicadamente lavar esferoides com ~ 120 µ l de mídia ensaio aquecido e pré-calibrados, Aspire e repita a lavagem duas vezes. Inspecione os esferoides sob o microscópio novamente para garantir que esferoides não são lavados. Preparar a microplaca de ensaio esferoide adicionando mídia de ensaio quente 180 µ l de cada poço. Definir uma P20 micropipeta de 10 µ l e caber uma ponta larga entediada para isso. Se larga entediadas dicas não estiverem disponíveis, cortar as pontas das pontas de pipetas regular com uma tesoura limpa ou bisturi para alargar o furo. Nota: Isso deve reduzir a distorção e preservar a morfologia geral dos esferoides enquanto sendo transferido para ensaio placas. Usar uma superfície quente (37 ° C) para realizar a transferência de esferoides. Use uma superfície de visualizador de filme de raio-x aquecida com uma lâmpada de luz branca para realçar o contraste e visualização de esferoides durante o processo de transferência de auxílio. Cuidadosamente aspirado um esferoide pre-lavado único da placa de crescimento celular repelente usando uma micropipeta P20 equipado com uma ampla furo ponta e suavemente esferoide de transferência diretamente para o centro de cada poço da placa de ensaio esferoide para efectuar a metabólica do ensaio. Permitir que cada spheroid para cair suavemente a microcâmara central de cada poço pela gravidade pura para preencher a placa de ensaio. Nota: Normalmente leva 5-8 s para cada spheroid para cair no centro do poço por gravidade. Não puxe a pipeta até os esferoides se estabeleceram na microcâmara. Fazer não depósito esferoides em poços de 4 canto da placa de ensaio (A1, A12, H1, H12) uma vez que estes serão usados como poços fundo. Monitorar a morfologia e a posição de cada spheroid para garantir que cada esferoide é no centro de cada poço. Se necessário, reposicione ao centro do poço aspirando fora esferoide usando uma ampla furo ponta da pipeta e subsequente deposição pela gravidade. Uma vez que foram transferidos todos os esferoides, coloque a placa de ensaio em uma incubadora de ar umidificado de 37 ° C (não-CO 2) para antes de uma hora do ensaio. Carregar cartucho de sensor de compostos ao realizar o ensaio preparar 10 × concentrou-se na mídia específica do ensaio descrita na etapa 2.1.2 reagentes específicos de ensaio. Por exemplo, realizar GST, reconstituir a glicose, oligomicina e 2-DG em volumes recomendados referido no manual do ensaio. GST e o MST ensaios foram realizados usando Patu8902-PS1 esferoides. Corretamente orientar o cartucho do sensor com linhas rotuladas A-H no lado de mão esquerda e colocar um guia de carregamento no topo do cartucho do sensor. Garantir o correto carregamento de porta desejada pelo orientando o carregamento de guia para que a letra correspondente à porta para ser carregado no canto superior esquerdo. Usando uma pipeta multicanal, dispense os reagentes diretamente em portos de injeção. Mantenha guias de carregamento em posição usando a ponta dos dedos ao longo do processo. Nota: Cada reagente será injetado em uma porta recomendada prevista no manual de ensaio. Evitar a criação de bolhas de ar, mas não toque em qualquer parte do cartucho para remover as bolhas de ar. Remover a guia de carregamento e posição ao nível dos olhos com cartucho para inspecionar visualmente portos de injeção para o mesmo carregamento. Criar o protocolo de projeto/instrumento de ensaio experimental usando o controlador do instrumento software onda (doravante, o software de análise), conforme descrito na seção 2.3. Ensaio design e execução usando o software de análise criar um modelo de ensaio para o experimento abrir o software de análise e clique em " modelos " ou escolher um ensaio existente modelo. Clique duas vezes no " modelo em branco ". Definir grupos experimentais e condições. Estratégias de injeção definir para portas A, B e C. deixar vazio de Porto D. Nota: Para o ensaio da GST, somente essas portas, estarão com glicose, oligomicina e 2-DG. No caso de ensaio de MST, oligomicina, FCCP e rotenona serão carregados. Definir pré-tratamentos se esferoides foram tratados com um ou mais compostos de teste e grupo controle. Definir os meios de ensaio para incluir fonte, suplementos e outras informações. Definir um ou mais tipo de células (por exemplo, Patu8902, PS1) ver a informação do número densidade e passagem. Clique " gerar grupos de ". Clique " placa mapa " guia e atribuir grupos para a placa de ensaio correspondente para o delineamento experimental. Selecione os poços de quatro canto como poços de fundo. Certifique-se de que não há nenhum esferoides nesses poços. Executar ensaio no analisador clique na guia instrumento protocolo manter o padrão comandos do protocolo verificando " calibrar ", " equilíbrio " e " ciclo de medição da linha de base ". Clique " injeções " e definir compostos para cada porta. Edite ciclos de medição para 6 ciclos padrão de 3 ciclos de esferoides. Mantenha a mistura de 3 min padrão, 0 min espera e vezes de medida 3 min. Nota: Tempos de mistura-espera-medida padrão são 3 min, min 0, 3 min, respectivamente. Três medições da taxa basal normalmente são tomadas antes da injeção do primeiro ensaio de composto. Estas medições podem ser calibradas e reajustadas conforme o delineamento. Revisão de protocolo e Resumo do grupo. Salvar ensaio projeto modelo. Proceder à calibração do pré-ensaio uma vez que os portos de injeção foram carregados com substratos de ensaio. Transferir o cartucho com a placa de utilidade para o analisador de fluxo extracelular. Nota: Este geralmente é concluída no prazo de 15 a 20 min e calibra os sensores para realizar medidas de OCR e ECAR. Após a calibração do cartucho, substitua a placa de utilidade com a placa de ensaio pré-aquecido contendo esferoides 3D e iniciar o ensaio. Após concluídas as medições, exportar os dados para a planilha ou software de gráfico e estatístico para analisar os dados.

Representative Results

O fluxo de trabalho geral para bioprinting magnética e análise de fluxo extracelular de esferoides 3D A Figura 1 mostra uma visão geral de todo o processo descrito neste protocolo. Células de câncer pancreático (Patu8902) e células estreladas ativadas (PS1) foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos que contém a mídia de crescimento adequado para uma confluência de 70-80%. As células foram desanexadas da nave cultura 2D e lavagem, densidade celular estava determinada e células finalmente resuspended em meios de crescimento a 1 × 106 células/mL. NS, uma montagem de nanopartículas de poli-L-lisina, óxido de ferro e ouro foi utilizado para magnetizar as células. Magnetizada individualmente as células Patu8902 e PS1 então foram misturadas e impressas em placas de 96 poços de crescimento celular repelente montadas em uma unidade magnética esferoide. Otimizamos a 15.000 para ser o número total de células para semeadura de um único poço (5.000 células Patu8902 misturados com 10.000 células PS1 para gerar um único esferoide). Após a incubação, em condições de cultura de tecido apropriado para 5-7 dias, foram obtidos 3-dimensional esferoides, tempo durante o qual o crescimento desses esferoides foi monitorado e gravado. Após a lavagem com mídia de ensaio, esferoides fisicamente foram transferidos para uma esferoide microplacas para realizar ensaios metabólicos, utilizando um analisador de fluxo extracelular para a medida simultânea da glicólise e respiração mitocondrial. Cultura e crescimento de esferoides de tumor pancreático-fibroblastoPara obter esferoides funcionais e robustos, a célula de câncer epitelial linha Patu8902 e ativado células estreladas PS1 foram cultivados em RPMI-1640, suplementado com soro fetal bovino. Pat8902 e células de PS1 magnetizadas com NS foram então misturadas na proporção de 1:2, a fim de propagar um total de 15.000 células por poço em uma placa de crescimento. Dentro de 24 h de imprimir as células para as unidades magnéticas, células focalizado para o centro do poço exatamente no topo de cada Peão magnético sob cada poço. Crescimento de esferoides Patu8902-PS1 foi monitorado pela imagem latente nos dias 2, 4, 7 e 9, após a semeadura de células. A Figura 2 mostra a quantificação do diâmetro médio de esferoides representativos em vários pontos do tempo acima. O diâmetro de esferoides aumenta de 414 µm no dia 2 para 596 µm no 7º dia pós impressão. Não houve diferença significativa entre crescimento nos dias 7 e 9, e assim, todas as outras experimentação foi limitada a 7 dias de crescimento de esferoide. Percebemos que os esferoides adquirem uma morfologia mais nítida, especialmente ao redor das bordas exteriores e o NS progressivamente é mais uniformemente difusa em todo o volume do spheroid com mais dias em cultura. Também estimamos a esfericidade de 10 esferoides baseado no comprimento dos seus eixos maiores e menores. A esfericidade média é 0,92 ± 0,04 para Patu8902 sozinho (tumor), 0.95 ± 0,04 para PS1 (estroma) sozinho e 0,94 ± 0,02 para esferoides co-cultura. Ensaio metabólico funcional do pâncreas esferoides 3D usando o analisador de fluxo extracelularPara testar a funcionalidade dos esferoides, utilizamos metabólica e análise bioenergética para sondar os caminhos da energia no esferoides. Foi realizado um teste de estresse de glicólise em esferoides cultivadas como descrito acima. Para este fim, esferoides gerados a partir de células ou Patu8902 ou PS1 além das resultantes de uma cultura co a tipos de duas células foram submetidas a ensaio. Curiosamente, todos os três tipos de esferoides, se originários de células distintas ou mistas, exibiram uma resposta biologicamente funcional para o ensaio de GST. Ao injetar uma concentração saturante de glicose, os tipos de esferoides testaram mostrar aumentos na via glicolítico como evidenciado por um aumento na ECAR (Figura 3). Quando, a produção de ATP mitocondrial foi inibida usando oligomicina, produção de energia muda para a glicólise e empurrado células para capacidade máxima glicolítico, vista como aumento ECAR. Inibição da glicólise usando 2-DG, uma glicose analógico que liga-se competitivamente glicose hexoquinase, resultado em uma diminuição na ECAR, confirmando que o aumento prévio ECAR foi devido à atividade glicolítico. Notamos que os esferoides testadas neste estudo responderam desta forma, embora os PS1 sozinhos esferoides (diâmetro médio de 250 µm) tinham um sinal relativamente menor, possivelmente devido a seu tamanho menor e menor capacidade glicolítico comparado ao câncer de Patu8902 células (diâmetro médio 600 µm). Em geral, uma maior ECAR sinal da célula de tumor derivada esferoides comparados de relativamente menor do fibroblasto PS1 derivado esferoides, possivelmente poderia ser atribuída a inclinação de metabólica inerente das células câncer para glicólise22, 23. Todos os três tipos de esferoides foram derivados de semear o mesmo número de células, embora notamos variação de tamanho de esferoide entre cada tipo, com PS1 esferoides sozinhos sendo menor, seguido de esferoides co-cultura, e esferoides sozinhos Patu8902 sendo o maior. Para testar a função mitocondrial em 3D esferoides, sujeitámos esferoides co-cultura para um ensaio do MST. O MST mede parâmetros-chave de função mitocondrial medindo diretamente o OCR de células (Figura 4A e 4B). Uma injeção serial com compostos (oligomicina, FCCP e uma mistura de rotenona e antimycin A) foi usada para medir parâmetros mitocondriais-chave tais como, produção de ATP, respiração máxima e respiração mitocondrial-não. Estes parâmetros e taxas de respiração basal mais foram usadas para calcular a fuga de próton e capacidade respiratória (Figura 4). Uma diminuição em OCR em resposta a oligomicina, um inibidor da ATP sintetase (complexo V) se correlaciona com a respiração mitocondrial associada à produção de ATP celular. Esferoides foram incubados com oligomicina para uma duração mais longa permitir a penetração máxima e tempo de resposta eficiente. Uma segunda injeção com o desacoplador FCCP estimula o consumo máximo de oxigênio e um aumento correspondente no OCR. O OCR Compararia-estimulada foi utilizado para calcular a capacidade respiratória, uma medida da capacidade da célula para responder à procura crescente de energia. A terceira injeção; uma mistura de rotenona, (um complexo eu inibidor) e antimycin A (um inibidor do complexo III) bloqueia a respiração mitocondrial, vista como uma diminuição acentuada em OCR (Figura 4BONG >). Em geral, nossas observações confirmam a funcionalidade de esferoides cultivadas usando um analisador de fluxo extracelular como uma medida de sua pegada/atividade metabólica tanto em termos de potencial mitocondrial e glicolítico, como descrito acima. Figura 1 . Representação esquemática da metodologia para a cultura e o ensaio de esferoides de células de fibroblastos/câncer de pâncreas. Patu8902 e PS1cells foram cultivadas, trypsinized, lavados e contados. Para a propagação cada esferoide, Patu8902 (5.000 células/poço) e fibroblastos PS1 (10.000 células/poço) foram magnetizados usando NS e impresso em uma placa de crescimento celular repelente no dia 1. Após a semeadura, a placa de crescimento foi montada em uma unidade de esferoide magnético (com um íman em cada poço da placa de crescimento de 96 formato bem) e permitiu a cultura para 2-7 dias obter 3D esferoides. Os resultantes esferoides foram lavados e transferidos para as esferoide ensaio microplacas para realizar os ensaios metabólicos no instrumento fluxo extracelular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 . Crescimento de esferoides de tumor pancreático-fibroblasto. (A) uma imagem representativa do esferoide de co-cultura Patu8902-PS1 correspondente ao dia da cultura é mostrada na parte superior e o tamanho de diâmetro do spheroid (µm) é quantificado abaixo. Aumento progressivo no tamanho de esferoide e difusão de partículas do NS (pontos escuros) em todo o seu volume é evidente entre os dias 2 e 7. Esferoides foram mantidas em cultura por mais dias 2 depois disto, que não resultou em um aumento significativo do diâmetro de esferoide. (B) representante fotos de esferoides derivados de células tumorais (Patu8902), células do estroma (PS1) e células cultivadas co (Patu8902 + PS1) é mostrado. Dados (C) a esfericidade são retratados de 10 esferoides individuais de cada grupo. Barras de erro representam o desvio padrão (SD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 . Teste de estresse de glicólise (GST) com esferoides pancreáticos. (A) representação esquemática de um ensaio de típica função glicolítico com diversos parâmetros de ensaio descrito. (B) um exemplo de um teste de GST realizada sobre os pâncreas esferoides cultivadas usando a metodologia descrita. Rampas de injeção de glicose acima de glicólise, visto como um aumento na ECAR, com aumento na adição de oligomicina para desligar a respiração mitocondrial. ECAR cai em resposta a 2-DG, um análogo do competidor da glicose, através do bloqueio de glicólise. Todos os esferoides são anotados para expor uma resposta funcional para o ensaio de GST. (C) uma saída do ensaio GST usando o gerador de relatórios do fabricante retratando os três principais parâmetros do ensaio do GST. Barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Teste de Stress mitocondrial (MST) com Patu8902-PS1 esferoides. (A) representação esquemática de um ensaio de típica função mitocondrial com diversos parâmetros de ensaio é retratada. (B) um exemplo de um MST em esferoides o tumor pancreático-fibroblasto é mostrado. Esferoides 3D (C) co-cultura exibem uma resposta funcional para o ensaio do MST. Como esperado, função mitocondrial medida como um declínio em OCR foi notada quando esferoides foram desafiados com oligomicina, inibidor de ATP sintase. Usar FCCP para aumentar o fluxo de elétrons resultou em OCR máxima, que imediatamente entrou em colapso após a inibição da respiração mitocondrial usando um – coquetel de inibidores de complexos mitocondriais. Barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Usando o câncer de pâncreas, o 3^rd principal causadora de câncer relacionados mortes nos Estados Unidos²⁴, como um exemplo e um modelo, um método rápido e consistente foi desenvolvido para crescer e ensaio esferoides 3D usando a co-cultura de células de câncer pancreático e activado no pâncreas fibroblastos. Usando bioprinting magnético, obtiveram-se esferoides variando em tamanho de 400-600 µm de diâmetro. Estas foram submetidas a ensaios metabólicos para testar com sucesso a funcionalidade dos culturas esferoides 3D. Este método é simples, consistente e pode ser facilmente adaptado para outros tipos de células.

Enquanto esta metodologia vai acelerar e aumentar o valor de translação dos ensaios realizados com esferoides 3D, pode ser melhorado através do desenvolvimento de técnicas que permitem multiplexação de manipulação esferoide e manipulação. Isso deve reduzir o tempo total, custo e o trabalho necessário para realizar o ensaio. Além disso, volumes esferoide podem ser usados para normalizar o OCR sinais como relatado por outros⁶. Volume de esferoide normalizado pelo volume médio de uma célula pode ser usado para determinar o OCR por célula, mas desde que o crescimento de esferoides não será idêntico, calcular um OCR absoluto por célula pode ser um desafio. Atualmente, esta metodologia é limitada pela falta de uma ferramenta eficiente para manipulação de esferoide multiplex e transferência das placas de crescimento a ensaiar o ambiente.

O método descrito é modificado e adaptado a partir da tecnologia de bioprinting magnética e mais validado para mostrar a relevância funcional aplicando os esferoides cultivadas para um ensaio metabólico a jusante. O método fornece uma ferramenta importante para gerar esferoides robustas, viáveis e funcionais que contêm os dois tipos principais de célula encontrados na maioria dos tecidos do tumor, as células cancerosas e fibroblastos de cancro associado, que podem ser empregados para outros ensaios experimentais, tais como telas de drogas. A relativa facilidade e a eficiência da metodologia NS é uma grande melhoria sobre outros métodos²⁵, tais como a suspensão drop método²^,²⁶ da geração de esferoide.

Esferoides robustos gerados como tal fornecem um em vitro modelo de tumor que inclui células do estroma, que muitas vezes estão falta em muitos estudos de cultura 3D. As possibilidades de aplicação de modelos 3D esferoide gerado como tal são vastas. Por exemplo, tais modelos podem ser empregados para investigar interações célula-célula, turnos de Bioenergética e testar a susceptibilidade genética e dependência de vários regimes terapêuticos. Esferoides 3D que recapitular o microambiente do tumor na vivo servem como ferramenta altamente relevante e úteis para estudos e aqueles investigando os mecanismos de ação da terapêutica atual e inovador de despistagem de drogas. Ensaios metabólicos sondando caminhos de energia usando esferoides culturas com as células mutantes podem ajudar a lançar uma nova luz sobre o papel desses genes e vias relacionadas no Patobiológico em um modelo 3D relevante de câncer, como os esferoides descritos neste estudo.

O sucesso da aplicação deste método baseia-se, acima de tudo, sobre a saúde das células necessárias para a impressão magnética, é por isso que a célula crescendo em fase logarítmica deve ser colhida e magnetizada. É fundamental usar a unidade magnética esferoide para imprimir células magnetizadas e não a unidade de exploração, que deve ser utilizada apenas durante a lavagem de esferoide e mídia reabastecendo etapas do método descrito. O outro aspecto mais crítico de leitura bem sucedida de ensaios metabólicas é manter a morfologia dos esferoides durante o processo de transferência da placa de crescimento para a placa de ensaio.

Em geral, este protocolo foi estabelecido para geração de esferoides 3D que contêm células do estroma, após o ensaio metabólico subsequente dos esferoides usando o analisador de fluxo extracelular e câncer. As principais características desse método são que é rápida, facilmente adaptável e consistentes, relevantes para e imita o microambiente do tumor na vivo , é relativamente barato e pode servir como uma nova ferramenta para estudar a biologia do tumor e desenvolver anticâncer agentes.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer Samuel Zirbel assistência no monitoramento de crescimento esferoide e otimizando as condições de cultura. Estamos gratos à Agilent technologies para fornecer o analisador^e96 XF de cavalos-marinhos, os reagentes do ensaio e conhecimentos técnicos. Agradecemos também Dr. Hemant Kocher Barts Cancer Institute no Reino Unido para fornecer as células do PS1. Este trabalho foi financiado em parte pela Fundação Magowitz viu um para pesquisa do câncer no pâncreas e um Stand até câncer-câncer Research UK-Lustgarten Fundação pancreático câncer sonho equipe bolsa de investigação (Grant Number: SU2C-AACR-DT-20-16). Stand Up para câncer é um programa da Entertainment Industry Foundation. Bolsas de investigação são administradas pela Associação Americana para pesquisa do câncer, o parceiro científico de SU2C.

Materials

0.05% Trypsin EDTA	Sigma	25300-054
96 well cell repellant plate	USA Scientific/ Griener Bio-One	655970	spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
D-Glucose	Sigma	D9434
DPBS	Gibco	14190-144
Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
L-Glutamine	Sigma	59202C
Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent Technologies	103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C
Patu8902 cells	Laboratory Stock		pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells	Laboratory Stock		activated pancreatic stellate cells
RPMI1640	Gibco	11875-093	growth media for cells, spheroids
SeaHorse XF^e96 extracellular flux analyzer	Agilent Technologies		extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636
XF Base media	Agilent Technologies	102365-100	base media for metabolic assays on XF^e96

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3D Spheroid Co-culture Pancreatic Cancer Cells Fibroblasts Metabolic Assay Extracellular Flux Analysis Tumor Microenvironment Cell Magnetization Nanoshuttle Magnetic Spheroid Drive

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Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).