High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Stefan H. Geyer; Barbara Maurer-Gesek; Lukas F. Reissig; Wolfgang J. Weninger

doi:10.3791/56071

JoVE Journal > Developmental Biology

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Gelişim Biyolojisi

Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

Published: July 07, 2017

doi:

10.3791/56071

Stefan H. Geyer¹, Barbara Maurer-Gesek¹, Lukas F. Reissig¹, Wolfgang J. Weninger¹

¹Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC,Medical University of Vienna

Özet

Wir bieten einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung von Biopsiematerialien verschiedener Arten, Embryonen biomedizinischer Modellorganismen und Proben von anderen organischen Geweben, um eine digitale Volumendatenerzeugung mit der hochauflösenden episkopischen Mikroskopie zu ermöglichen.

Abstract

Wir bieten einfache Protokolle zur Erstellung digitaler Volumendaten mit der hochauflösenden episkopischen Mikroskopie (HREM) Methode. HREM ist in der Lage, organische Materialien mit Volumina bis zu 5 x 5 x 7 mm ³ in typischen numerischen Auflösungen zwischen 1 x 1 x 1 und 5 x 5 x 5 μm ³ abzubilden. Die Proben werden in Methacrylatharz eingebettet und auf ein Mikrotom geschnitten. Nach jedem Abschnitt wird ein Bild der Blockoberfläche mit einer digitalen Videokamera aufgenommen, die auf dem mit dem zusammengesetzten Mikroskopkopf verbundenen Phototube sitzt. Die optische Achse durchläuft einen Filterwürfel aus grünem fluoreszierendem Protein (GFP) und ist mit einer Position ausgerichtet, an der der Bockhalterarm nach jedem Abschnitt ruht. Auf diese Weise wird eine Reihe von inhärent ausgerichteten digitalen Bildern erzeugt, die nachfolgende Blockflächen anzeigen. Das Laden einer solchen Bildserie in die dreidimensionale (3D) Visualisierungssoftware erleichtert die sofortige Umwandlung in digitale Volumendaten, die virtuelle s erlaubenEctioning in verschiedenen orthogonalen und schrägen Ebenen und die Schaffung von Volumen und Oberfläche gerendert Computer-Modelle. Wir präsentieren drei einfache, gewebespezifische Protokolle für die Verarbeitung verschiedener Gruppen von organischen Proben, einschließlich Maus-, Küken-, Wachtel-, Frosch- und Zebelfisch-Embryonen, menschliches Biopsie-Material, unbeschichtetes Papier und Hautersatzmaterial.

Introduction

Die strukturelle Analyse von organischen und anorganischen Materialien ist der erste Schritt zum Verständnis ihrer physikalischen Eigenschaften und ihrer Funktion. Die Grundlage für eine solche Analyse ist oft die zweidimensionale (2D) Information, die durch sorgfältige Beobachtung von histologischen Abschnitten gewonnen wird, mit einer Vielzahl einfacher und anspruchsvoller Bildgebungsverfahren, die Details der Gewebearchitektur, Zellmorphologie und Topologie, molekulare Zusammensetzung und biomechanische Eigenschaften extrahieren ¹ ^, ² ^, ³ Allerdings eignet sich 2D-Information nicht für die Erforschung räumlich komplexer Arrangements. Daher wurde in den letzten Jahrzehnten eine wachsende Zahl von In-vivo- und Ex-vivo- Methoden, die die Erzeugung von digitalen Volumendaten ermöglichen, etabliert und viele weitere sind in der Entwicklung.

Das methodische Prinzip der meisten Volumenerzeugungsverfahren ist die Erzeugung von virtuellen StacksVon digitalen Bildern, die Abschnitte anzeigen, die durch virtuelle oder physikalische Teilung eines Objekts gewonnen werden. Wenn die Sektionsbilder ordnungsgemäß ausgerichtet sind, erzeugt dies ein Volume, das in virtuellen Sektionsebenen neu geschnitten werden kann oder für die Erstellung von 3D-Oberflächen- und Volume-gerenderten Modellen verwendet wird. Beliebte Techniken zur Visualisierung von Menschen und größeren biologischen Proben sind Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT), Positronenemissionstomographie (PET) und Einzelphotonenemissions-Computertomographie (SPECT). Kleine Exemplare werden in der Regel durch mikro-magnetische Resonanztomographie (μMRI), optische Projektionstomographie (OPT), optische Kohärenztomographie (OCT), photoakustische Tomographie (PAT), histologische Sektionsbasierte Methoden, konfokale Mikroskopie und Elektronentomographie ⁵ ^, ⁶ visualisiert ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ <sUp>, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ .

Eine relativ neue Volumendatenerzeugungstechnik, die digitale Daten von kleinen Exemplaren und histologischen Gewebeproben erzeugt, ist die HREM-Methode, die in enger Kooperation mit Tim Mohun ¹⁸ ^, ^{19 entwickelt wurde} . Es handelt sich um eine einfache mikroskopbasierte Technik, die digitale Volumendaten aus harzgebundenem Material erzeugt, das auf einem Mikrotom geschnitten ist. Die Daten ermöglichen eine detaillierte Analyse der Gewebearchitektur und der Zellverteilungen sowie der metrischen Analyse von kleinen Merkmalen auf einer mittleren Lichtmikroskopie.

HREM produziert Stapel von inhärent ausgerichteten digitalen Bildern, die wie aus e erkannt erscheinenOsin gefärbte histologische Abschnitte. Der Gewebekontrast und die Datenauflösung in Bezug auf das Gesichtsfeld übersteigen die von μCT, μMRI und OPT erzeugten Daten, sind aber niedriger als bei konfokaler Licht- und Elektronenmikroskopie ²⁰ . Im Gegensatz zu letzterem ist HREM jedoch in der Lage, Proben mit relativ großen Volumina von bis zu 5 x 5 x 7 mm ³ in histologischer Qualität zu visualisieren. Eine Reihe von neueren Studien liefern detaillierte Charakterisierungen und Vergleiche von Vor- und Nachteilen der einzelnen bildgebenden Verfahren und beziehen sich im Hinblick auf die Objektivität auf diejenigen, die weitere Informationen über ihre Einschränkungen und potentiellen Anwendungsfelder ⁴ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ ^, ²⁴

Diese Studie konzentriert sich auf die HREM Imaging-Methode und zielt darauf ab, zu bietenSehr einfache Protokolle zur Erzeugung von HREM-Daten eines breiten Spektrums von organischen Materialien sowie Beispiele für ihre Anwendung. Der Workflow zur Erstellung von HREM-Daten ist einfach und gilt für alle Materialien, die in Methacrylatharz eingebettet werden können ( Abbildung 1 ). Dennoch gibt es gewebespezifische Unterschiede in der Probenvorbereitung, die berücksichtigt werden müssen. Wir stellen daher drei Standardprotokolle zur Vorbereitung verschiedener Proben zur Verfügung. Einbettungs- und Datenerzeugungsprotokollschritte sind für alle identisch.

Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien an der Medizinischen Universität Wien durchgeführt. 1. Probenvorbereitung Vorbereitung von Embryonen und Embryogeweben (bis zu 5 x 5 x 5 mm 3 ) Fixieren Sie die Embryonen oder Teile der Embryonen in 4% PFA / PBS oder Bouins Fixiermittel bei 4 ° C für mindestens 16 – 24 h unter konstantem Schütteln. ANMERKUNG: Embryonen verschiedener Arten und verschiedener Entwicklungsstadien können verwendet werden, wie 48-h-Zebrafisch, 19-h-Küken und Wachtel, sowie pränatale Mausembryonen, die hier verwendet wurden (siehe Repräsentative Ergebnisse ). Die Proben wurden geerntet und in PBS bei Raumtemperatur zur Inszenierung überführt, bevor sie fixiert wurden. Bei Bedarf die Proben mit Mikroscheren oder Skalpellen vor der Fixierung an die Einbettungsformen anpassen. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie das Embryogewebe in PBS bei 4 ° C unter konstantem RockinG für 24 h (2-3 änderungen). Die Proben in 70%, 80%, 90%, 96% Ethanol bei 4 ° C für jeweils 2 – 3 h dehydratisieren. Legen Sie die Röhrchen mit den Proben auf einen Rotator. HINWEIS: Bei kleinen Proben (<2 x 2 x 2 mm 3 ) kann die Zeit, die eine Probe in jedem Ethanol aufnimmt, auf 60 min reduziert werden. Bei großen Proben (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) kann es auf 4 h verlängert werden. Führen Sie die folgenden Infiltrationsschritte unter einer Dunstabzugshaube mit Schutzhandschuhen durch. Die Infiltrationslösung durch Zugabe von 1,25 g Benzoylperoxid (plastifizierter Katalysator) und 0,4 g Eosin auf 100 ml Lösung A (weitere Einzelheiten siehe Tabelle der Materialien ) vorbereiten . In einem Becher auf einer Magnetrührplatte bei 4 ° C aufrühren, bis Eosin und Katalysator vollständig aufgelöst sind (2 – 3 h). Legen Sie die Proben für 12 – 24 h in die Infiltrationslösung. Halten Sie es bei 4 ° C unter kontinuierlichem Schütteln oder Drehen. Ersetzen Sie die Infiltrationslösung nach 3 und 12 mit frischer LösungH. HINWEIS: Verlängern Sie die Infiltrationszeit auf 48 h für große Embryonen (> 1 cm Krone / Rumpflänge). Vorbereitung von adulten Gewebeproben (bis zu 5 x 5 x 7 mm 3 ) Fixieren Sie die Gewebe in 2% PFA / PBS, enthaltend 4% Karbolsäure bei 4 ° C für mindestens 3 Tage. ANMERKUNG: Gewebeprobe, die aus Haut, Leber, Bauchspeicheldrüse, Niere, Schilddrüse, Herz, gestreiften Muskeln, Gehirn, Nerven und Tumormodellen von mehreren Neugeborenen und erwachsenen Menschen, Nagetiere, Schweine, Fruchtfliegen und Zebrastreifen in dieser Lösung fixiert werden kann Und dann für die HREM-Bildgebung verarbeitet (wir zeigen die Fixierung der Proben, siehe Repräsentative Ergebnisse ). Heben Sie die Gewebeproben mit Skalpellen, Scheren oder Biopsie-Schlägen an und überweisen sie direkt in Fixiermittel. Zur Fixierung von Nervengewebe verwenden Sie 4% PFA / PBS. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie das Gewebe unter fließendem Leitungswasser für 3-6 h. Dehydrieren Sie die Proben nachträglichSie in 70%, 80%, 90%, 96% Ethanol, gemischt mit 0,4 g Eosin pro 100 mL (jeweils 2 – 3 h). Halten Sie die Lösungen mit Proben bei 4 ° C unter konstantem Schütteln oder auf einem Rotator. HINWEIS: Bei kleinen Proben (<2 x 2 x 2 mm 3 ) kann die Zeit, die eine Probe in jedem Ethanol aufnimmt, auf 60 min reduziert werden. Bei großen Proben (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) kann es auf 4-8 h verlängert werden. Führen Sie alle folgenden Infiltrationsschritte unter einer Dunstabzugshaube mit Schutzhandschuhen durch. Die Infiltrationslösung durch Zugabe von 1,25 g Benzoylperoxid (plastifizierter Katalysator) und 0,4 g Eosin auf 100 ml Lösung A (weitere Einzelheiten siehe Tabelle der Materialien ) vorbereiten . In einem Becher auf einer Magnetrührplatte bei 4 ° C rühren, bis der Eosin und der Katalysator vollständig aufgelöst sind (2 – 3 h). Legen Sie Proben in die Infiltrationslösung für 24 – 36 h. Halten Sie es bei 4 ° C unter kontinuierlichem Schütteln oder Drehen. Ersetzen Sie die Infiltrationslösung nach 3 und nach der frischen Lösung12 h. HINWEIS: Bei großen Proben (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) verlängern Sie die Infiltrationszeit auf 48 h. Vorbereitung anderer organischer Stoffe HINWEIS: Trim Hautersatz und Papier auf die gewünschte Größe mit gewöhnlichen Schere. Es ist keine Fixierung erforderlich. Überspringen, Waschen und Austrocknen. Führen Sie alle folgenden Infiltrationsschritte unter einer Dunstabzugshaube mit Schutzhandschuhen durch. Die Infiltrationslösung durch Zugabe von 1,25 g Benzoylperoxid (plastifizierter Katalysator) und 0,4 g Eosin auf 100 ml Lösung A (weitere Einzelheiten siehe Tabelle der Materialien ) vorbereiten . In einem Becher bei 4 ° C auf einer Magnetrührplatte umrühren, bis Eosin und Katalysator vollständig gelöst sind (2 – 3 h). Legen Sie Proben in Infiltrationslösung für 3 – 12 h. Halten Sie es bei 4 ° C unter kontinuierlichem Schütteln oder Drehen. Ersetzen Sie die Infiltrationslösung nach 1 und 2 – 4 h mit frischer Lösung. </ Li> 2. Einbettung HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter einer Dunstabzugshaube mit Schutzhandschuhen durch. Vorbereiten der frischen Infiltrationslösung wie oben beschrieben (Schritt 1.1.4.1). Füge 4 ml Lösung B hinzu (für Details siehe Tabelle der Materialien ) bis 100 ml Infiltrationslösung zur Herstellung der Einbettungslösung. HINWEIS: Wenn eine präzise Ausrichtung der Probe in den Einbettungsformen erforderlich ist und die Einbettung mehrerer Proben parallel erfolgt, verlangsamen Sie die Polymerisation der Stammlösung, indem Sie das Becherglas in ein Eisbad geben. Für Formteile mit einem Routinevolumen von 6 x 8 x 5 mm 3 oder 13 x 19 x 5 mm 3 oder kundenspezifischen Formen mit Volumina bis zu 8 x 10 x 15 mm verwenden 3 ( Fig. 2 ). Füllen Sie die Formen mit Einbettungslösung und überführen Sie die Probe in die Form mitein Löffel. Während des Transports sicherstellen, dass die Probe vollständig mit Einbettungslösung bedeckt ist, um eine Luftfalle zu vermeiden. HINWEIS: Dies kann bei Raumtemperatur erfolgen, wenn sofort nach dem Sammeln der Proben und der Einbettungslösung aus dem Kühlschrank begonnen wird. Orientieren Sie die Probe in die Form mit Nadeln oder Pinzette. Sobald die Einbettungslösung viskos wird, legen Sie einen Blockhalter (siehe Tabelle der Materialien ) auf die Form und fügen Sie die Einbettungslösung durch das zentrale Loch des Blockhalters ein, bis der Boden des Blockhalters mit 1 – 2 bedeckt ist Mm Einbettungslösung. Dichtung des Formschalenbehälters durch Abdecken mit flüssigem Paraffinwachs und warten, bis es gehärtet ist. Alternativ ein zweites Formschalen-Tablett mit der Unterseite auf die Formschale mit Proben legen und mit Klebeband auf luftdicht abdichten. Lassen Sie die Blöcke, um die Polymerisation zu beenden, indem Sie die versiegelten Formschalen für 1 -2 Tage bei Raumtemperatur. Für die Nachpolymerisationsbearbeitung legen Sie die Formschalen mit den polymerisierten Blöcken in einen Standard-Laborofen und backen bei 70 – 80 ° C für mindestens 1 – 2 Tage, bis sie dunkelrot werden. Sammeln Sie die Tabletts aus dem Ofen und entfernen Sie die Blöcke aus der Form. HINWEIS: Das Backen kann unter normalen Umgebungsbedingungen erfolgen. Die Abdeckfolie, die in der ersten Phase nach dem Einbetten eine luftdichte Abdichtung gewährleistet, kann entfernt werden, um die Farbe des Harzes nach 10 h zu überprüfen. Unmittelbar nach dem Backen ist das Harz weich und die Blöcke können leicht aus dem Spritzbecher entfernt werden. Innerhalb von 2 – 3 h sind sie hart und können bei Raumtemperatur für mehrere Monate gelagert werden. 3. Datenerzeugung HINWEIS: Der hier verwendete HREM-Prototyp 18 , 25 umfasst die folgenden Punkte: (i) Rotationsmikrotom mit BlockblockDer nach jedem Schnitt an seinem oberen Wendepunkt aufhört. (Ii) Standard, nicht wegwerfbares Mikrotommesser, Hartmetall, Profil D (Details siehe Tabelle der Werkstoffe ). (Iii) Kopf des Fluoreszenzmikroskops mit Objektivrevolver und GFP-Filterwürfel (Erregung 470/40, Emissionsfilter 525/50) in seiner optischen Achse. Die optische Achse ist senkrecht zur frisch geschnittenen Fläche eines auf dem Mikrotom angebrachten Blocks angeordnet und wird von einer Vorrichtung gehalten, die eine Auf- und Abwärtsbewegung ermöglicht. (Iv) Motorischer Kreuztisch mit dem Mikrotom. Der Tisch kann in Richtung der optischen Achse und seitlich verschoben werden. (V) Digitale Videokamera, die an das Mikroskop mit fluoreszierender Verbindung angeschlossen ist. (Vi) Monochrome Lichtquelle (470 nm). (Vii) Computer an die Kamera angeschlossen, mit Datenerzeugungssoftware (Details siehe Tabelle der Materialien ). Verfahren Geben Sie die Region von Interesse an. Standardlabor verwendenGht Quelle (siehe Tabelle der Materialien ), um das weiße Licht schräg zur Blockoberfläche zu leiten. Identifizieren Sie die Umrisse des eingebetteten Materials, wie es auf die Blockoberfläche projiziert. Geben Sie den interessierenden Bereich und das spätere Sichtfeld auf die Blockoberfläche mit einem Stift oder Rasierklinge an. HINWEIS: Dieser Schritt ist zwingend erforderlich, um das Ausmaß des Sichtfeldes vor dem Schnitt zu definieren. Definiere das Sichtfeld. Montieren Sie den Harzblock mit Probe auf dem Mikrotom. Bewegen Sie den Blockhalter in seine Stoppposition (oberer Wendepunkt der Blockhalterauslenkung). Starten Sie die Digitalkamera und Datenerzeugungssoftware und erwerben Sie ein Livebild. Wählen Sie eine Objektivlinse mit einer geeigneten Vergrößerung, um den auf der Blockoberfläche angegebenen Bereich zu decken. HINWEIS: Ziele mit Vergrößerungen 2.5X, 5X, 10X, 20X und numerische Blenden zwischen 0,07 und 0,40 werden häufig verwendet. </liAufrechtzuerhalten Bewegen Sie die Optik nach oben und nach unten und das Mikrotom seitlich mit dem motorisierten Kreuztisch, bis der interessierende Bereich mit dem auf dem Computerbildschirm angezeigten Sichtfeld übereinstimmt. Fokus. Führen Sie Schritt für Schritt manuelles Schneiden durch, bis erste Strukturen der Probe sichtbar werden. Ordnen Sie die Blockoberfläche in der Fokusebene der Optik an, indem Sie das Mikrotom in Richtung der optischen Achse bewegen. Wählen Sie Abschnitt Dicke; Abschnittsdicken von 0,5 bis 5 μm werden empfohlen. Datenerzeugung und -verarbeitung Starten Sie die Software-Routine, die das Schneiden und die Bilderfassung orchestriert. Befolgen Sie die dokumentierte Anleitung der Imaging-Capturing-Software. Stoppen Sie die Software-Routine und legen Sie eine Skalierung Folie vor der Blockoberfläche, sobald die Probe vollständig geschnitten ist. Erfassen Sie ein Bild interaktiv für spätere Kalibra. HINWEIS: Dies muss jedes Mal geschehen, wenn ein Objektiv in einem neu angeordneten Setup verwendet wird. Konvertieren Sie die Bildserie in 8-Bit-Graustufenbilder im Format .jpg. Laden Sie Bildreihen in 3D-Visualisierungssoftware und passen Sie Kontraste an. HINWEIS: Die Bildkonvertierung und die 3D-Visualisierung können mit verschiedenen handelsüblichen oder frei verfügbaren Standard-Softwarepaketen nach den Anweisungen der jeweiligen Software erfolgen.

Representative Results

HREM erzeugt eine Reihe von inhärent ausgerichteten digitalen Bildern mit Kontrasten ähnlich den Bildern von Hämatoxylin / Eosin-gefärbten histologischen Abschnitten. Im Gegensatz zu 2D-Schnittbildern ermöglichen Stapel von HREM-Bildern die Visualisierung und Analyse der Gewebearchitektur, der Morphologie und der Topologie einer breiten Vielfalt an organischen Materialien in 3D. Der hohe Kontrast erleichtert oftmals eine schnelle und einfache 3D-Visualisierung von volumengesteuerten Computermodellen und halbautomatischen Konturbefunden für die Erzeugung von Oberflächenmodellen. Die Größe der HREM-Daten variiert je nach Größe des Kameradargets, dem Modus der Bildaufnahme (8, 12, 16 Bit, Graustufen, Farbe) und der Anzahl der einzelnen Blockbildbilder. Kleinere Datensätze von 1.000 8-bit.jpg Graustufenbildern von 2.048 Pixeln x 2.048 Pixeln haben eine Größe von ca. 900 MB. Größere Datensätze von 3.000 8-bit.jpg Graustufenbildern von 4.096 pIxel x 4,096 Pixel haben Volumen von ca. 20 GB. Die Protokolle sind einfach und robust, und während des letzten Jahrzehnts wurden sie zur Erzeugung von HREM-Daten von vielen verschiedenen Exemplaren eingesetzt. Protokoll 1.1 wurde für die Verarbeitung von ganzen Embryonen biomedizinischer Modellorganismen mit einer Länge von bis zu 1 cm und Embryo-Gewebeproben mit einer Abmessung von bis zu 5 x 5 x 5 mm 3 optimiert; Wir haben diese Methode zur Herstellung von HREM-Daten von Embryonen der folgenden Spezies verwendet: Maus ( Mus Musculus) , Chick ( Gallus gallus ), Zebra Fisch ( Danio rerio ), Wachtel ( Coturnix Coturnix) , afrikanischer Krallenfrosch ( Xenopus laevis ), Pferd ( Equus ferus caballus ), Softweed Bug ( Oncopeltus fasciatus ), Krokodil ( Crocodylia ) und Oktopus ( Octopus vulgaris ). Die Daten aller Arten waren von hervorragender Qualität ( zB Abbildung 3 ) <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Protokollabschnitt 1.2 wurde für die Verarbeitung von juvenilen und adulten Gewebeproben mit Abmessungen bis zu 5 x 5 x 7 mm 3 optimiert und zur Visualisierung von Gewebeproben der Haut, Leber, Pankreas, Niere, Schilddrüse, Herz, gestreifter Muskel, Gehirn, Nerven und Tumormodelle, die von Menschen geerntet wurden ( Homo sapiens ), Mäuse ( Mus Musculus ), Ratten ( Rattus norvegicus ), Schweine ( Sus scrofa domestica ) Frettchen ( Mustela Furo ), Fruchtfliege ( Drosophila melanogaster ) und Zebrafisch ( Danio rerio ). Während die Ergebnisse bei den meisten Exemplaren hervorragend waren ( z. B. Abbildung 4 , Animation 1 ), blieben die sehr zentralen Teile der Haut (mit Epidermis) und Hirnproben größer als 3 x 3 x 3 mm 3 oft unbemerkt wegen unzureichender Penetration von Eosin durch Diese Gewebe. Protokoll sEction 1.3 wurde für die Verarbeitung von faserigem organischem Material optimiert und zur Visualisierung der Faserarchitektur von gestrichenem Papier, unbeschichtetem Papier, nativem dermalen Substitutionsmaterial und stammzellgestemmtem Hautmaterial verwendet. Diese Proben waren einfach und schnell zu verarbeiten. Die Daten des unbeschichteten Papiers und der meisten Hautersatzstoffe waren von guter Qualität ( Abbildung 5 , Animation 2 ). Bei der Verarbeitung des beschichteten Papiers traten Probleme auf, als das anorganische Material das Eindringen von Eosin behinderte. Ein anderes Problem trat bei der Verarbeitung der Hautersatzstoffe auf der Basis von Agar auf, weil sie teilweise durch die Infiltrationslösung verdaut wurden. Abbildung 1: Workflow. Die in den roten Boxen gezeigten Schritte erfordern Änderungen nach den Mustermerkmalen. Schritte in den grünen Kästen sind die, dieSind in allen Proben ähnlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Kundenspezifische Formen. Formen können angepasst werden, indem man ein Loch in die ursprüngliche Form schneidet, die Glühbirne einer Pasteurpipette einsetzt und mit dem Modelliermaterial versiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Beispielhaft sichtbare Embryonen. (A, B) Mausembryo am embryonalen Tag geerntet, E = 9,5. HREM-Schnittbild ist in (A) </Stark>. Lautstärke gerendertes 3D-Modell, das die Oberfläche zeigt, ist in (B) gezeigt . (C) Virtueller sagittaler Schnitt durch ein Volumenmodell des Halses eines E15.5-Maus-Embryos. (D) Chick-Embryo bei der Entwicklung Hamburger Hamilton (HH) Stufe 18. Oberflächenmodell der Lumina der Herz-Kreislauf-Komponenten kombiniert mit Volumen-Rendering aller Embryo-Gewebe. Maßstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Beispielhaft ausgewiesene erwachsene Gewebeproben. (A) Teil eines HREM-Schnittbildes durch einen menschlichen Nerv. Inlay zeigt einen Abschnitt des Bildes im Detail. (B) Teil eines HREM-Schnittbildes durch Schweineleber. Beachten Sie die nUclei (C) Teil eines HREM-Schnittbildes menschlichen Lymphgewebes (D, E) Dichte Haut eines menschlichen Daumenpolsters Volumen gerendertes 3D-Modell der gesamten Biopsie. (D) Oberfläche gerenderten Modelle von Arterien, Venen und Nerven vor einer virtuellen Resektion durch HREM-Daten (E) . (F) Experimenteller Tumor im erwachsenen Mausgewebe Volume gerendert 3D-Modell vor drei virtuellen Abschnitten durch HREM-Daten. Beachten Sie die nekrotischen Teile (Pfeilspitzen). Maßstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5: Beispielhaft fasziniertes Material. (A, B) HREM-Schnittbild von unbeschichtetem, braunem Papier (B) </sTrong> zeigt einen Abschnitt von (A) . Beachten Sie die Fasern und ihr Lumen. (C) HREM-Abschnitt aus gestrichenem Papier Beachten Sie, dass die Fasern ungefärbt bleiben. (D) Volumenmodell des nativen Hautmaterials. Beachten Sie das unterschiedliche Kaliber und die Form der Fasern. Maßstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Animation 1: Volume Rendered Modell der dicken Haut eines menschlichen Thumb Pad. Die Größe des Gewebeblocks beträgt etwa 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . Voxelgröße beträgt 1,07 x 1,07 x 2 μm 3 . Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download). <pclass > Animation 2: Volume Rendered Modell des Native Dermal Ersatzmaterials. Die Größe der Probe beträgt etwa 1,2 x 0,85 x 0,4 mm 3 . Voxelgröße beträgt 0,54 x 0,54 x 2 μm 3 . Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download).

Discussion

HREM ist ein äußerst robustes mikroskopisches Verfahren, das sich ideal für die Visualisierung eines breiten Spektrums an organischen Materialien in der Biomedizin und der Industrie ¹⁸ ^, ²¹ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ ^, ²⁹ ^, ³⁰ ^, ³¹ ^, ³² ^, ³³ ^, ³⁴ ^, ³⁵ ^, ³⁶ ^, ^{37 befindet} ^, ³⁸ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ . Es kann als exklusive Bildgebungsmodalität eingesetzt werden, wie es derzeit von den Programmen der Entwicklungsstörungen (DMDD) ⁴¹ ^, ^{42 verwendet wird} <suP>, ⁴³ ^, ⁴⁴ oder als integrativen Teil der multimodalen Abbildungspipelines ⁴⁵ .

Eine voll funktionsfähige HREM-Datenerzeugungsvorrichtung kann aus herkömmlichen Laborkomponenten zusammengesetzt sein und umfasst ein motorisiertes Mikrotom, ein Mikroskop, einen motorisierten Kreuztisch und einen Computer mit entsprechender Software ²⁵ . Es ist entscheidend, ein Mikrotom zu verwenden, das mit einem Blockhalter ausgestattet ist, der nach jedem Abschnitt an einer definierten Position reproduzierbar anhält und GFP-Filterwürfel innerhalb des optischen Weges. Allerdings können voll funktionsfähige All-Inclusive-Lösungen von Unternehmen wie Indigo Scientific bezogen werden.

HREM steht den gleichen Einschränkungen wie alle histologischen Techniken gegenüber, mit der Ausnahme, dass keine Artefakte während der Schnitt- oder Schnittmontage eingeführt werden. Allerdings gibt es Einschränkungen, die sich aus der Notwendigkeit ergeben, die Proben vor dem Schneiden zu färben undAus den Eigenschaften des Einbettungsmaterials. Das Eindringen von Eosin durch die gesamte Probe ist erforderlich, um ausreichende Gewebekontraste zu erhalten; Sehr dichtes Material, Fettgewebe und anorganische Stoffe beeinträchtigen die Eosinpenetration und dies führt zu ungefärbten Geweben im Zentrum der Objekte. Mit speziellen Fixativen hilft Fleck Hautproben, aber es gibt noch keine richtige Methode für die vollständige Überwindung des Problems. Eine weitere Einschränkung ist, dass Harze, die mehr als 2 cm blockieren, dazu neigen, während des Schnittes zu brechen. Dies kann zum Teil durch das Schneiden der Proben und der Verarbeitung von Teilen getrennt vermieden werden.

Eine korrekte Positionierung von kleinen Proben oder Proben mit unregelmäßigen Oberflächen in den Formen während der Einbettung ist oft problematisch. Die Abdeckung der Proben mit Agarose und die Verarbeitung der Agaroseblöcke, wie in dem Protokoll beschrieben, löst normalerweise dieses Problem ¹⁹ . Ein alternativer Ansatz, der auch hilft, wenn Blöcke während secti brechenEs ist, den bereits gehärteten Block aus seinem Halter zu entfernen und ihn nach dem beschriebenen Einbettungsverfahren neu einzubetten.

Ein typischer HREM-Datensatz umfasst 500 bis 3.000 Einzelbilder. Seine numerische Auflösung wird durch den Abstand zwischen den aufeinanderfolgenden Bildern ( dh durch Schnittdicke), die Charakteristik des Kameradargets und die Eigenschaften der verwendeten Optik bestimmt. Wir verwendeten Schnittdicken zwischen 1 μm und 5 μm und erzielten gute Ergebnisse, obwohl die dargestellten Protokolle nicht vollständig aus den Artefakten ²⁰ ^, ⁴⁶ eliminieren. Diese Artefakte werden durch intensiv gefärbte Gewebe verursacht, die tief im Inneren des Blocks liegen, was zu einer Verwischung der Gewebeinformation auf den Blockoberflächen führt.

Die Kameras hatten Zielabmessungen von 2.560 x 1.920 Pixel ² , 2.048 x 2.048 Pixel ² und 4.096 x 4.096 Pixel ² und waren KombiMit 1,25X, 2,5X, 5X, 10X und 20X Objektiven. Dies führte zu numerischen Pixelgrößen zwischen 0,18 x 0,18 μm ² und 5,92 x 5,92 μm ² , was sich als ausreichend für die 3D-Analyse von Gewebearchitektur und Zellformen und sogar zur Visualisierung von Kernen erwies. Angesichts der hohen numerischen Auflösung sollten auch andere Zellorganellen sichtbar sein. Unzureichende Kontraste durch einfache Eosin-Färbung, und die optischen Eigenschaften der Ziele drastisch verringern die Möglichkeit, Strukturen zu unterscheiden. Die maximal wahre Ortsauflösung der HREM-Daten, die die numerische Apertur berücksichtigt, beträgt etwa 1 x 1 x 1 μm ³ und erlaubt somit nur eine effektive Diskriminierung von Strukturen größer als etwa 3 x 3 x 3 μm ³ .

Ein gemeinsames Problem für alle digitalen bildgebenden Techniken ist der Kompromiß zwischen der Größe des Gesichtsfeldes, das den Teil der Probe definiert, der angezeigt werden kannD auf dem Kameradiel und die numerische Auflösung des Bildes. Je größer das Sichtfeld, desto geringer die maximal mögliche numerische Auflösung ⁴⁶ . Der hier verwendete HREM-Aufbau erlaubt die Erzeugung von HREM-Daten mit einem Sichtfeld zwischen 0,74 x 0,7 mm ² (20X Objektiv), das in einer numerischen Auflösung von 0,18 x 0,18 μm ² und 12,12 x 12,12 mm ² (1,25X Objektiv) angezeigt wird Eine numerische Auflösung von 2,96 x 2,96 μm ² . Alternative, kommerzialisierte Setups können größere Sichtfelder bieten, aber auf Kosten der wahren Auflösung. Dennoch bieten sie hervorragende Ergebnisse, wie aus den Daten auf der Homepage des DMDD-Programms ^{47 hervorgeht} .

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Tim Mohun für seine ungleichen Beiträge bei der Entwicklung von HREM und Petra Heffeter für die Bereitstellung von Proben.

Materials

JB-4 Plus Embedding Kit	Polysciences Europe GmbH	18570-1	includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B
Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities)	Polysciences Europe GmbH	17177A-3
Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities)	Polysciences Europe GmbH	17177C-3
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences Europe GmbH	15899-50
Eosin	Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma	1A-196
Microtec CUT 4060E			rotary microtome
Leica DM LM, fluorescence compound microscope	Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP filter set	Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H	11090937180000
Motorised cross table	Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG	KT5-LSMA
Digital video camera SPOT-FLEX	Visitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LED	Visitron Systems GmbH.		light source
VisiView 2.1.4	Visitron Systems GmbH.		Image capturing software
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D	Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCD	Schott AG		light source

Referanslar

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High-resolution Episcopic Microscopy (HREM)Organic Materials 3D Analysis Visualization Biomedical Research Dehydration Infiltration Embedding Volume Data Model Organisms Wound Healing

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Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B., Reissig, L. F., Weninger, W. J. High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) – Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials. J. Vis. Exp. (125), e56071, doi:10.3791/56071 (2017).