نحن نقدم بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة المواد خزعة من مختلف الأنواع والأجنة من الكائنات الحية الحيوية نموذج والعينات من الأنسجة العضوية الأخرى من أجل السماح الرقمية توليد البيانات حجم مع عالية الدقة المنهج المجهري إبيسكوبيك.
نحن نقدم بروتوكولات بسيطة لتوليد البيانات حجم الرقمية مع عالية الدقة ابيسكوبي المجهري (هريم) الأسلوب. هريم قادر على تصوير المواد العضوية مع وحدات التخزين تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 في قرارات رقمية نموذجية بين 1 × 1 × 1 و 5 × 5 × 5 ميكرون 3 . يتم تضمين العينات في راتنج ميثاكريلات ومقسم على مشراح. بعد كل قسم يتم التقاط صورة من سطح كتلة مع كاميرا الفيديو الرقمية التي يجلس على فوتوتوب متصلا رئيس المجهر المركب. المحور البصري يمر عبر بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) مرشح مكعب ويتماشى مع الموقف، الذي الذراع بوك حامل يأتي للراحة بعد كل قسم. وبهذه الطريقة، يتم إنتاج سلسلة من الصور الرقمية الانحياز بطبيعتها، وعرض الأسطح كتلة لاحقة. تحميل مثل هذه السلسلة صورة في ثلاثي الأبعاد (3D) برنامج التصور يسهل التحويل الفوري إلى البيانات حجم الرقمية، والتي تسمح الظاهرية قإكتينغ في مختلف الطائرات المتعامدة والمائلة وإنشاء حجم والسطحية نماذج الكمبيوتر المقدمة. نقدم ثلاثة بروتوكولات محددة، الأنسجة محددة لمعالجة مجموعات مختلفة من العينات العضوية، بما في ذلك الماوس والفرخ والسمان والضفدع والأجنة زيبرا الأسماك، والمواد خزعة الإنسان، ورقة غير مصقول ومواد استبدال الجلد.
التحليل الهيكلي للمواد العضوية وغير العضوية هو الخطوة الأولى في فهم الخواص الفيزيائية والوظيفة. أساس هذا التحليل في كثير من الأحيان هو ثنائي الأبعاد المعلومات (2D) المكتسبة من قبل مراقبة دقيقة من الأقسام النسيجية، مع مجموعة متنوعة من أساليب التصوير بسيطة ومتطورة التي تستخرج تفاصيل بنية الأنسجة، مورفولوجيا الخلية والطوبولوجيا والتكوين الجزيئي والخصائص الميكانيكية الحيوية 1 ، 2 ، 3 . ومع ذلك، فإن المعلومات 2D غير مناسبة للبحث الترتيبات المعقدة مكانيا. وبالتالي فإن عددا متزايدا من في الجسم الحي والطرق خارج الجسم الحي التي تسمح بإنشاء بيانات حجم الرقمية في العقود الأخيرة 4 وغيرها الكثير قيد التطوير.
المبدأ المنهجي لمعظم أساليب توليد البيانات حجم هو توليد مداخن الظاهريمن الصور الرقمية التي تعرض المقاطع المكتسبة عن طريق التقسيم الظاهري أو المادي للكائن. إذا تم محاذاة الصور القسم بشكل صحيح، وهذا يخلق وحدة تخزين، والتي يمكن إعادة المقطع في طائرات القسم الظاهري، أو استخدامها لخلق 3D سطح وحجم النماذج المقدمة. التقنيات الشائعة لتصور البشر وعينات بيولوجية أكبر هي التصوير المقطعي بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي المحوسب والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (بيت) والتصوير المقطعي بالانبعاث أحادي الفوتون (سبيكت). وعادة ما تصور العينات الصغيرة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المغنطيسي (التصوير المقطعي بالرنين المغناطيسي) والتصوير المقطعي الضوئي البصري (أوبت) والتصوير المقطعي البصري التماسك (أوكت) والتصوير المقطعي الضوئي (بات) والطرق القائمة على التقطيع النسيجي والمجهر البؤري والتصوير المقطعي بالإلكترون 5 و 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 <sأوب>، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 .
وهناك طريقة جديدة نسبيا لتوليد البيانات الحجمية، والتي تنتج بيانات رقمية من العينات الصغيرة وعينات الأنسجة النسيجية هي طريقة هريم، الذي تم تطويره بالتعاون الوثيق مع تيم موهون 18 ، 19 . بل هو تقنية المجهر بسيطة تستند، الذي يولد البيانات حجم الرقمية من الراتنج جزءا لا يتجزأ من المواد التي مقطوع على مشراح. البيانات تسهيل تحليل مفصل لهندسة الأنسجة والتوزيعات الخلية وكذلك تحليل متري من الميزات الصغيرة على المستوى المجهري ضوء المتوسطة.
تنتج هريم مجموعات من الصور الرقمية المحاذاة بطبيعتها والتي تظهر كما لو تم التقاطها من eأوسين أقسام نسيجية ملطخة. تباين الأنسجة ودقة البيانات فيما يتعلق مجال الرؤية تتجاوز تلك التي تنتجها مع μCT، μMRI، والأراضي الفلسطينية المحتلة، ولكن أقل من ذلك يمكن تحقيقه مع متحد البؤر، ورقة ضوء والمجهر الإلكتروني 20 . ومع ذلك، وعلى النقيض من هذا الأخير، هرم قادر على تصور العينات مع كميات كبيرة نسبيا تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 في الجودة النسيجية. وهناك عدد من الدراسات الحديثة توفر خصائص مفصلة ومقارنات من مزايا وعيوب تقنيات التصوير واحد و، من أجل الموضوعية، نشير إلى تلك لمزيد من المعلومات بشأن القيود والمجالات المحتملة من التطبيقات 4 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 .
وتركز هذه الدراسة على طريقة التصوير هرم ويهدف إلى توفيروبروتوكولات بسيطة جدا لتوليد البيانات هرم من مجموعة واسعة من المواد العضوية، فضلا عن أمثلة لتطبيقها. سير العمل لإنشاء بيانات هرم بسيطة ويسري على جميع المواد التي يمكن تضمينها في راتنج ميثاكريلات ( الشكل 1 ). ومع ذلك هناك اختلافات محددة الأنسجة في إعداد العينة، التي تحتاج إلى النظر فيها. ولذلك فإننا نقدم ثلاثة بروتوكولات القياسية لإعداد عينات مختلفة. التضمين وخطوات بروتوكول توليد البيانات متطابقة لكل منهم.
هريم هو طريقة مجهرية قوية للغاية التي هي مثالية لتصور مجموعة واسعة من المواد العضوية المستخدمة في الطب الحيوي والصناعة 18 و 21 و 26 و 27 و 28 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 ، 38 ، 39 ، 40 . ويمكن استخدامه كطريقة تصوير حصرية، كما تستخدم حاليا من قبل آليات اضطرابات النمو (دمد) برنامج 41 ، 42 <sup>، 43 ، 44 ، أو كجزء تكاملي من خطوط الأنابيب التصوير المتعدد الوسائط 45 .
ويمكن تجميع جهاز توليد البيانات هرم يعمل بشكل كامل من مكونات المختبر التقليدية ويضم مشراح الآلية، المجهر، طاولة الصليب الآلية، وجهاز كمبيوتر مع البرامج المناسبة 25 . فمن الأهمية بمكان لاستخدام مشراح مجهزة حامل كتلة التي تتكاثر بشكل متكرر بعد كل قسم في موقف محدد ومكعبات مرشح غفب داخل المسار البصري. ومع ذلك، يمكن شراء حلول شاملة تماما من شركات مثل إنديجو سسينتيفيك.
يواجه هرم نفس القيود مثل جميع التقنيات النسيجية، إلا أنه لا يتم إدخال أي القطع الأثرية أثناء التقسيم أو قسم التركيب. ومع ذلك، هناك قيود، والتي تنتج عن ضرورة وصمة عار العينات قبل التقسيم ومن خصائص مادة التضمين. مطلوب اختراق يوزين من خلال العينة بأكملها للحصول على تناقضات الأنسجة كافية. مواد كثيفة جدا، والأنسجة الدهنية والمواد غير العضوية تعيق بشكل فعال يوزين الاختراق وهذا يؤدي إلى الأنسجة غير ملوثين في وسط الكائنات. باستخدام مثبتات خاصة يساعد على وصمة عار عينات الجلد، ولكن لا يزال هناك أي طريقة مناسبة للتغلب على المشكلة تماما. هناك قيود أخرى هي أن الراتنجات التي تمنع أعلى من 2 سم تميل إلى كسر أثناء التقسيم. ويمكن تجنب ذلك جزئيا عن طريق قطع العينات وأجزاء المعالجة بشكل منفصل.
تحديد المواقع الصحيحة من العينات الصغيرة أو العينات مع الأسطح غير النظامية في القوالب أثناء التضمين غالبا ما يكون إشكالية. تغطي العينات مع الاغاروز وتجهيز كتل الاغاروز كما هو موضح في البروتوكول عادة ما يحل هذه المسألة 19 . نهج بديل، الذي يساعد أيضا إذا كتل كسر خلال سكتيعلى إزالة كتلة صلبة بالفعل من حاملها وتضمينها من جديد، بعد إجراء التضمين وصفها.
وتتألف مجموعة بيانات نموذجية هرم من 500 إلى 3000 صورة مفردة. يتم تحديد قرارها العددي عن طريق المسافة بين الصور المتعاقبة ( أي ، من خلال سمك القسم)، وخاصية الهدف الكاميرا، وخصائص البصريات المستخدمة. استخدمنا سمك القسم بين 1 ميكرون و 5 ميكرون وحققت نتائج جيدة، على الرغم من أن البروتوكولات المقدمة لا القضاء تماما مشرقة من التحف 20 ، 46 . وتنتج هذه التحف عن طريق الأنسجة الملطخة بشكل مكثف تقع في عمق كتلة، مما أدى إلى طمس معلومات الأنسجة على أسطح كتلة من قبل.
كانت الكاميرات تستهدف أبعاد 2،560 × 1،920 بكسل 2 ، 2،048 × 2،048 بكسل 2 ، و 4،096 × 4،096 بكسل 2 وكانت كومبينيد مع 1.25X، 2.5X، 5X، 10X، و 20X العدسات الموضوعية. وأدى هذا إلى أحجام بكسل رقمية بين 0.18 × 0.18 ميكرون 2 و 5.92 × 5.92 ميكرون 2 ، والتي أثبتت أنها كافية لتحليل 3D من بنية الأنسجة والأشكال الخلية، وحتى لتصور نوى. ونظرا لارتفاع القرار الرقمي، يجب أن تكون عضيات الخلايا الأخرى مرئية كذلك. تناقضات غير كافية بسبب تلطيخ يوسين بسيطة، والخصائص البصرية للأهداف يقلل بشكل كبير من إمكانية التمييز الهياكل. القرار المكاني الحقيقي الأقصى للبيانات هرم، الذي يأخذ في الاعتبار الفتحة الرقمية، هو تقريبا 1 × 1 × 1 ميكرون 3 ، وبالتالي يسمح فقط التمييز الفعال للهياكل أكبر من حوالي 3 × 3 × 3 ميكرون 3 .
وهناك مشكلة مشتركة لجميع تقنيات التصوير الرقمي هو التبادل بين حجم مجال الرؤية، والذي يحدد جزء من العينة التي يمكن عرضهاd على هدف الكاميرا، والقرار الرقمي للصورة. وكلما كان مجال الرؤية أكبر، كلما انخفض القرار الرقمي الأقصى 46 . يسمح الإعداد هرم المستخدمة هنا توليد بيانات هرم مع مجال الرؤية بين 0.74 × 0.74 مم 2 (20X الهدف) عرضها في قرار رقمي 0.18 × 0.18 ميكرون 2 و 12.12 × 12.12 مم 2 (1.25X الهدف) المعروضة في وهو قرار رقمي 2.96 × 2.96 ميكرون 2 . يمكن للمجموعات البديلة والمتجانسة أن توفر مجالات أوسع من وجهات النظر، ولكن على حساب الحل الحقيقي. ومع ذلك، فإنها توفر نتائج ممتازة، كما يتضح من البيانات المعروضة على الصفحة الرئيسية لبرنامج دمد 47 .
The authors have nothing to disclose.
المؤلفين أشكر تيم موهون لمساهماته إنفالوبال في تطوير هرم والبتراء هفيتر لتقديم العينات.
JB-4 Plus Embedding Kit | Polysciences Europe GmbH | 18570-1 | includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B |
Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177A-3 | |
Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177C-3 | |
JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences Europe GmbH | 15899-50 | |
Eosin | Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma | 1A-196 | |
Microtec CUT 4060E | rotary microtome | ||
Leica DM LM, fluorescence compound microscope | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
GFP filter set | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | 11090937180000 | |
Motorised cross table | Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG | KT5-LSMA | |
Digital video camera SPOT-FLEX | Visitron Systems GmbH. | ||
precisExcite High-Power LED | Visitron Systems GmbH. | light source | |
VisiView 2.1.4 | Visitron Systems GmbH. | Image capturing software | |
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
KL 2500 LCD | Schott AG | light source |