단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동
Özet
네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용을 분석하기위한 기본적인 도구입니다. 전통적으로 대부분의 실험에서는 수직 겔을 사용했습니다. 그러나, 수평 겔은 전기 영동 중에 복합체를 모니터링 할 수있는 기회와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 우리는 수평 네이티브 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용의 생화학 적 분석에 광범위하게 사용 되어온 분자 생물학의 기본 도구입니다. 이러한 상호 작용은 전통적으로 두 개의 유리판 사이에 생성 된 폴리 아크릴 아미드 젤과 수직으로 전기 영동 된 샘플로 분석되었습니다. 그러나, 폴리 아크릴 아미드 겔은 트레이에 캐스팅되고 수평으로 전기 영동 됨으로써 여러 이점을 제공합니다. 예를 들어, 형광 RNA 기질과 특정 단백질 사이의 복합체를 분석하는 데 사용되는 수평 젤은 전기 영동이 진행됨에 따라 여러 번 이미지화 될 수 있습니다. 이것은 실험 중 여러 지점에서 RNA- 단백질 복합체를 모니터 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 또한, 수평 겔 전기 영동으로 많은 샘플을 동시에 분석 할 수 있습니다. 이것은 시간 경과 실험을 용이하게 할뿐만 아니라 여러 반응을 동시에 분석하여 여러 구성 요소와 조건을 비교할 수 있습니다. 여기에 우리가 홍보RNA-Protein 상호 작용을 분석하기 위해 수평 고유 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs)는 특정 단백질 – 핵산 상호 작용을 분석하는 귀중한 생화학 도구임이 입증되었습니다 1 , 2 , 3 . 이 분석법은 핵산 – 단백질 복합체 1 의 구성 화학 양롞 인 RNA 또는 DNA 3 에 대한 단백질의 결합 친 화성에 관한 중요한 정보를 제공하며 기질 경쟁 실험 1을 통해 RNA 결합 단백질의 결합 특이성에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공합니다 1 .
이 assays에 대한 전통적인 실험 설정은 정제 단백질과 방사성 표지 RNA 기판을 혼합하는 것으로 구성됩니다. 얻어진 복합체는 다음과 비 변성 분석 (네이티브) 폴리 아크릴 아미드 겔은 수직 장치 (3)에 시료 전기 영동 개의 유리판 사이에 붓고. 이 접근법은 핵산에 대한 단백질 결합의 기초가되는 생화학 적 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하기 위해 철저하게 사용되었지만 몇 가지 한계점이 있습니다. 예를 들어,이 기본 전략은 상대적으로 처리량이 낮으며 여러 바인딩 반응을 병렬로 분석해야하는 응용 프로그램에는 쉽게 적용 할 수 없습니다. 또한 전통적인 수직 장치의 경우 전기 영동 중 여러 번 복합체를 모니터링하는 것이 어렵습니다 3 , 4 .
여기에서는 평판 장치, 수평 전기 영동 및 형광 표지 된 RNA 기질 4 , 5 , 6 , 7에 주조 된 천연 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하는 EMSA 분석의 적용을 제시합니다. 기본 스트레인에 대한 이러한 비교적 간단한 변형의 결합tegy는 몇 가지 강력한 이점을 제공합니다. 특히 수평 플랫 베드 형식은 수십 개의 샘플을 동시에 분석하는 데 적합합니다 4 . 또한, Bicaudal-C 단백질과 RNA 기판 사이에 형성된 RNA- 단백질 복합체 (예 : 수평 겔에서 전기 영동)는 서로 다른 RNA- 단백질 복합체를 분해하고 이들을 미 결합 RNA 기질과 구별하는 능력이 향상되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
네이티브 폴리 아크릴 아마이드 젤은 단백질 -RNA 상호 작용을 조사하는 데 매우 중요한 도구이며 전통적으로이 젤은 수직으로 전기 영동됩니다 2 , 3 . 우리는 생성 된 전기 폴리 아크릴 아마이드 젤을 대체하여 1 , 4 , 6 , 7 , 15로 전…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 수치를 준비한 Laura Vanderploeg에게 감사드립니다. Sheets 연구소의 연구는 NSF 보조금 1050395 및 NIH 보조금 (R21HD076828)에 의해 지원됩니다. Ryder 연구소의 연구는 NIH 보조금 R01GM117237 및 R01GM117008에서 지원됩니다. Megan Dowdle은 위스콘신 – 매디슨 대학 (University of Wisconsin-Madison) 대학원 및 생명 공학 교육 프로그램을 통해 National Institute of Health (T32GM008349)의 국립 종합 의학 연구소를 통해 SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship의 지원을받습니다.
Materials
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
Referanslar
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