Özet

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

Published: November 27, 2017
doi:

Özet

Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.

Abstract

Terapias baseadas em células autólogas tem um passo mais próximo da realidade com a introdução de células-tronco pluripotentes induzidas. Células-tronco fetais, tais como o líquido amniótico e membrana células-tronco mesenquimais, representam um único tipo de células indiferenciadas com promessa em engenharia de tecidos e para reprogramação para iPSC para futuras intervenções pediátricas e células-tronco bancário. O protocolo aqui apresentado descreve um processo otimizado para a extração e cultivo primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco e gerando epissomal induzida por células-tronco pluripotentes dessas células em cultura totalmente quimicamente definida condições utilizando vitronectina recombinante humana e o meio de E8. Caracterização das novas linhas através da aplicação de métodos rigorosos – citometria de fluxo, imagem latente confocal, formação de teratoma e criação de perfil transcricional – também é descrita. As linhas recém-gerado expressam marcadores de células-tronco embrionárias – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – Apesar de ser negativa para o marcador SSEA-1. As linhas de células-tronco formam os teratomas em camundongos scid-bege em 6-8 semanas e os teratomas contêm tecidos representativos de todas as três camadas germinativas. Perfil transcricional das linhas através da apresentação de dados de microarray de expressão global para um algoritmo de avaliação de pluripotência bioinformatic considera-se todas as linhas pluripotentes e, portanto, esta abordagem é uma alternativa atraente à experimentação animal. As novas linhas de iPSC prontamente podem ser usadas em experimentos a jusante, envolvendo a otimização da diferenciação e da engenharia de tecidos.

Introduction

A tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) traz sobre potenciais terapias de substituição de células, doença e modelagem do desenvolvimento e drogas e triagem toxicológica1,2,3. Terapias de substituição conceitualmente pode ser alcançadas por injeção de célula, in vitro diferenciadas implantação de tecido (como patches cardíacas), ou guiada de regeneração por meio da engenharia de tecidos. O líquido amniótico (AFSC) e células-tronco da membrana (AMSC) também são uma excelente fonte de células para estas intervenções diretamente4,5,6,7 ou como uma população inicial de célula para reprogramação em pluripotência8,9,10,11,12.

Abordagens iniciais utilizados sistemas de cultura indefinido ou reprogramação métodos que exigem integração genômica de sucessão legal de constrói9,10,11,12. Um estudo mais recente empregado um meio livre de xeno, apesar de uma matriz de acessório de membrana basal menos definida (BMM) foi usada, para gerar iPSC de células epiteliais de líquido amniótico. No entanto, o ensaio de formação de teratoma não foi incluído no estudo junto com uma riqueza de dados moleculares e in vitro. Células epiteliais de líquido amniótico foram encontradas para ter um rendimento aproximadamente 8 vezes maior reprogramação quando comparado aos fibroblastos neonatais13. Em outro estudo, células-tronco mesenquimais do líquido amniótico também foram encontradas para ser reprogramado para iPSC com muita eficiência maior12.

Células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em representante de tecidos de todas as 3 camadas do germe e, portanto, têm o potencial mais amplo. Pacientes pediátricos poderiam beneficiar a colheita, reprogramação e engenharia de tecidos de suas células-tronco autólogas amnióticos fluidas pré-natal e haste de membrana amniótica células perinatal. Além disso, o nível relativamente baixo de diferenciação de células-tronco fetais (menores que as células estaminais adultas14,15) poderia teoricamente ajuda na abordando a observada retenção de viés epigenéticas de células de origem em iPSC16.

Aqui nós apresentamos um protocolo para reprogramação de líquido amniótico e membrana células-tronco de pluripotência em quimicamente definidos xeno-free E8 médio na recombinação vitronectina17 (VTN) usando plasmídeos epissomal18. A principal vantagem das células líquido e membrana amnióticos como fonte de células para reprogramação reside na sua disponibilidade pré e perinatal e, portanto, esta abordagem beneficiaria principalmente pesquisa em engenharia de tecidos pediátrica.

Protocol

O protocolo segue as orientações institucionais do Comitê de ética para a investigação humana. Consentimento por escrito do paciente foi obtido usando o líquido amniótico para pesquisa. Este protocolo segue as políticas do Comité de uso da Universidade do Sul do Alabama e institucional Cuidado Animal. 1. isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais amniótica primária Chapeamento de células de líquido amnióticos <ol…

Representative Results

Consentimento informado por escrito de pacientes foi obtido antes da colheita de líquido amniótico para fins de teste genético e dedicando uma pequena alíquota do líquido para pesquisa. Sem consentimento é necessário para o uso da membrana amniótica na pesquisa como a placenta representa resíduos médicos. Células-tronco de líquido e membrana amnióticos exibir propriedades típicas de mesenquimais, morfologicamente suas células são fusiformes e fase-brilhante. Após reprogra…

Discussion

A fase inicial de geração de iPSC de células estaminais fetais implica a extração de células de origem de tecidos fetais, sua cultura, expansão e introdução dos Plasmideos reprogramação epissomal. Esta fase é seguida de um período de cultura de cerca de 14-18 dias antes das primeiras colônias totalmente reprogramadas podem ser expandidas. A fase final é a maturação dos clones iPSC. A extração inicial de células-tronco membrana amniótica é conseguida por meio de uma digestão mecânica e enzimática …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Fonds Medizinische pesquisa na Universidade de Zurique, Forschungskredit da Universidade de Zurique, o NMS SCIEXCh sob bolsas 10.216 e 12.176, a sociedade Suíça de Cardiologia, a ciência nacional suíço Fundação sob concessão [320030-122273] e [310030-143992], o 7º programa-quadro, a válvula de vida, a Comissão Europeia sob concessão [242008], a Olga Mayenfisch Foundation, Fundação EMDO, a concessão de start-up 2012 do Hospital da Universidade de Zurique, e financiamento interno do Instituto de câncer de Mitchell.

Materials

Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 tissue dissociation system, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) Thermo-Fisher 3120032
70 µm cell strainers Corning 10054-456
RPMI 1640 medium Thermo-Fisher 32404014 
rocking platform VWR 40000-300
50 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339652
15 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339650
EBM-2 basal medium Lonza CC-3156 basal medium for AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) Prospec Bio CYT-218 bFGF, supplement for AFMC medium
EGF Human, Pichia Prospec Bio CYT-332  EGF, supplement for AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant Prospec Bio CYT-022 IGF, supplement for AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified Thermo-Fisher 10439024 FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo-Fisher 15240062  for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!
Accutase cell detachment solution StemCell Technologies 07920 cell detachment enzyme
CryoStor™ CS10 StemCell Technologies 07930 complete freezing medium
PBS, pH 7.4 Thermo-Fisher Scientific 10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362 for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2K Addgene 20925 EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K Addgene 20927 ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L Addgene 20926 M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000C spectrophotometer
Neon® Transfection System Thermo-Fisher MPK5000 transfection system, components:
Neon pipette – transfection pipette
Neon device – transfection device
Neon® Transfection System 10 µL Kit Thermo-Fisher MPK1025 consumables kit for the Neon Transfection System, it contains:
Neon tip – transfection tip
Neon tube – transfection tube
buffer R – resuspension buffer
buffer E – electrolytic buffer
Stemolecule™ Sodium Butyrate StemGent 04-0005 small molecule enhancer of reprogramming
TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 medium
Vitronectin XF™ StemCell Technologies 07180 VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer
CellAdhere™ Dilution Buffer StemCell Technologies 07183 vitronectin dilution buffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 dilute with PBS to 0.5 mM before use
EVOS® FL Imaging System Thermo-Fisher Scientific AMF4300 LCD imaging microscope system
CKX53 Inverted Microscope Olympus phase contrast cell culture microscope
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo-Fisher 28908 dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week
Perm Buffer III BD Biosciences 558050 permeabilization buffer, chill to -20 °C before use
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 557782 isotype control for Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 557783 isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 401617 isotype control for TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401618 isotype control for TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 400129 isotype control for SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401321 isotype control for SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 Jackson Immunoresearch 115-606-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 Jackson Immunoresearch 115-546-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
DAPI Thermo-Fisher Scientific D21490 stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free Corning 356231 basement membrane matrix (BMM)
scid-beige mice, female Taconic CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50) Qiagen 74134 RNA isolation kit
T-25 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156367
T-75 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156499
Nunc™ tissue-culture dish Thermo-Fisher 12-567-650  10 cm tissue culture dish
6-well plates, tissue-culture treated Thermo-Fisher 140675
Neubauer counting chamber (hemacytometer) VWR 15170-173
Mr. Frosty™ Freezing Container Thermo-Fisher 5100-0001  freezing container
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml Corning 352058 5 ml polystyrene tubes
Eppendorf tubes, 1.5 ml Thermo-Fisher 05-402-96 1.5 ml microcentrifuge tubes
PCR tubes, 200 µl Thermo-Fisher 14-222-262
pipette tips, 100 to 1250 µl Thermo-Fisher 02-707-407 narrow-bore 1 mL tips
pipette tips, 5 to 300 µl Thermo-Fisher 02-707-410
pipette tips, 0.1 to 10 µl Thermo-Fisher 02-707-437
wide-bore pipette tips, 1000 µl VWR 89049-166 wide-bore 1 mL tips
glass Pasteur pipettes Thermo-Fisher 13-678-20A
ethanol, 200 proof Thermo-Fisher 04-355-451
vortex mixer VWR 10153-842
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass Thermo-Fisher 155409 glass-bottom confocal-grade cultureware
22G needles VWR 82002-366
insulin syringes Thermo-Fisher 22-253-260
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixation of explanted teratomas
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip Illumina BD-103-0204 expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer
PrimeView Human Genome U219 Array Plate Thermo-Fisher 901605 expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array Thermo-Fisher 902482 expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest
PluriTest® Coriell Institute www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data
CellNet Johns Hopkins Üniversitesi cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).

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