Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis
Özet
Ce protocole décrit une méthode permettant d’observer l’embryogenèse chez Arabidopsis via clairance ovule, suivie par l’inspection de la formation embryonnaire sous un microscope.
Abstract
Étant donné la nature hautement prévisible de leur développement, Arabidopsis embryons ont servi comme modèle pour l’étude de la morphogénèse chez les plantes. Cependant, embryons plante au stade précoce sont petites et contiennent peu de cellules, ce qui les rend difficiles à observer et à analyser. On décrit ici une méthode pour caractériser la formation du patron chez les embryons de la plante sous un microscope à l’aide de l’organisme modèle Arabidopsis. Suite à l’apurement des ovules frais à l’aide de la solution de Hoyer, le nombre de cellules dans et la morphologie des embryons pouvaient être observés, et leur stade de développement peut être déterminée par le microscope à contraste interférentiel différentiel à l’aide d’un 100 X lentille d’immersion d’huile. En outre, l’expression de protéines spécifiques de marqueurs taggés avec la protéine fluorescente verte (GFP) a été suivie pour annoter la spécification identité des cellules au cours de la structuration de l’embryon par laser confocal, microscopie à balayage. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour observer la formation de modèles dans des embryons de plante sauvage aux niveaux cellulaires et moléculaires et de caractériser le rôle de certains gènes dans la structuration de l’embryon en comparant la formation du patron chez les embryons de type sauvage et des mutants létaux embryon. Par conséquent, la méthode peut servir à caractériser l’embryogenèse chez Arabidopsis.
Introduction
L’embryogenèse est l’événement plus tôt dans le développement de la plante. Une forme d’embryon mature d’un zygote à travers la division cellulaire et la différenciation sous strict contrôle génétique1,2. Arabidopsis embryons sont un modèle utile pour étudier le contrôle de la morphogenèse, parce que la séquence des divisions cellulaires au cours de l’embryogenèse suit un modèle attendu3,4. Cependant, un embryon d’Arabidopsis contenant un à plusieurs cellules est trop petit pour être observé et analysé. En outre, la mutation de certains gènes peut provoquer embryon létalité5, indiquant le rôle clé de ces gènes dans l’embryogenèse. La caractérisation de la formation chez les mutants létaux embryon fournit une base pour comprendre le mécanisme moléculaire par lequel gènes essentiels réglementent le développement des embryons.
Une méthode détaillée est décrite ici pour la caractérisation de la formation dans la plante modèle Arabidopsis embryon par observation microscopique. La méthode consiste à dégagement ovule, suivie de l’observation microscopique d’un embryon. La caractérisation d’un mutant embryon létale est également décrite.
La morphologie des embryons à des stades différents de développement peut être déterminée directement par microscopie les ovules qui ont été effacées avec solution6,7 de Hoyer. Ces ovules présentent un indice de réfraction élevé ; ainsi, cet ovule méthode de compensation est particulièrement avantageuse pour les échantillons qui doivent être observées au microscope (DIC) de contraste interférentiel différentiel.
En outre, les gènes qui sont exprimés dans une cellule particulière ou un nombre limité de cellules au cours de l’embryogenèse utilisable comme marqueurs pour identifier les cellules de l’embryon. Par conséquent, la spécification d’identité cellulaire au cours de l’embryogenèse peut être annotée en contrôlant l’expression des protéines GFP-étiquetée marqueur laser confocal, microscopie à balayage. À l’inverse, observant le modèle d’expression d’un gène fonctionnelle inconnue – fusion deGFP durant l’embryogenèse peut fournir un lien entre la structuration de l’embryon et l’expression de ce gène et faciliter l’identification de nouveaux gènes qui sont requises pour l’embryogenèse chez Arabidopsis.
La méthode décrite ici peut également être utilisée pour caractériser le phénotype d’un mutant embryon létal et pour déterminer l’impact du gène affecté sur l’embryogenèse au niveau cellulaire. En outre, en combinaison avec une comparaison du modèle d’expression des gènes marqueurs durant l’embryogenèse entre plantes sauvage et mutantes, la méthode peut donner des indices sur les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation impliquées dans l’embryogenèse8,9. En effet, la méthode a été appliquée aux plantes de naa10 , et il a été constaté que la division anormale de l’hypophyse chez le mutant peut être causée par un changement dans la répartition de l’auxine au cours de l’embryogenèse,5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dégagement de l’ovule est une méthode utile pour détecter la division cellulaire et d’évaluer la morphologie au cours de l’embryogenèse chez Arabidopsis; en utilisant cette technique, les embryons peuvent être observées directement sous DIC microscopie5,12. L’étape critique pour le dédouanement de l’ovule est étape 1.3.4. Le temps nécessaire au dégagement d’ovule dans étape 1.3.4 est variable. Embryons au stade de 2/4-cellules pe…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Jessica Habashi pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions le Dr Xianyong Sheng du centre d’imagerie, Collège des Sciences de la vie, Capital Normal University (Pékin), pour effectuer la localisation de dosage DR5-GFP . Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la Science de le Gouvernement Municipal Beijing (CIT & TCD20150102) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31600248).
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
Referanslar
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