表征在拟南芥胚方法
Özet
本议定书概述了观察胚胎发生的但在拟南芥中通过依次检查在显微镜下胚胎模式形成的胚珠间隙的方法。
Abstract
给出的发展高度可预测性，拟南芥胚胎有被用作模型研究植物的形态发生。然而，早期植物胚胎很小，包含几个细胞，使它们难以观察和分析。一种方法在这里描述中使用的模式生物拟南芥在显微镜下的植物胚胎模式形成。之后使用 Hoyer 解决方案的新鲜胚珠的间隙，可以观察胚胎形态学和细胞数目中的，和他们发育阶段可以由微分干涉相衬显微镜使用 100 X 油浸没透镜。此外，标记与绿色荧光蛋白 (GFP) 的特异性标记蛋白的表达被监视批注单元格标识规范期间胚胎模式通过共聚焦激光扫描显微镜。因此，可以使用此方法，观察野生型植物胚胎细胞和分子层面的模式形成和通过比较模式形成的胚胎从野生型植物和胚胎致死突变表征特定基因在胚胎模式中的作用。因此，该方法可以用于表征在拟南芥胚胎发生。
Introduction
胚胎发育是中高等植物发育最早的事件。成熟胚的形式从一个受精卵通过细胞分裂和分化在严格的遗传控制1，2下。拟南芥胚胎是一个有用的模型，研究形态发生的控制，因为胚胎发生过程中细胞分裂的顺序遵循预期的模式3，4。然而，包含一到多个单元格拟南芥胚是太小了，观察和分析。此外，某些基因的突变会导致胚胎致死5，指示这些基因在胚胎发生过程中的关键作用。在胚胎致死突变模式形成的表征为理解藉以必需基因调节胚胎发育的分子机制提供了依据。
详细的方法在这里描述为表征的模式植物拟南芥胚胎模式形成由直接的微观观察。该方法涉及然后微观观察的胚胎的胚珠间隙。此外介绍胚胎致死突变体的特性。
不同发育阶段的胚胎的形态学可以直接测定显微镜与霍耶的解决方案6，7使用已被清除的胚珠。这种胚珠表现出高的折射率;因此，这胚珠结算方法是特别有利的必须遵守微分干涉显微镜 (DIC) 的标本。
此外，基因在胚胎发育过程中都是在一个特定的细胞或细胞数量有限表示可以用作标记来识别中的胚胎细胞。因此，胚胎发生过程中的细胞标识规范可以注明通过监视使用共聚焦激光扫描显微镜的 GFP 标记的标记蛋白的表达。相反，观察未知功能基因GFP融合胚胎发生过程中的表达模式可提供胚胎模式与该基因的表达之间的联系及促进所需的拟南芥胚胎发育的新基因的鉴定。
描述表型的胚胎致命的突变体，并确定受影响的基因在胚胎发生在细胞水平上的影响，也可以使用这里介绍的方法。此外，结合比较的标记基因的表达模式之间野生型与突变型植物胚胎发生过程中，该方法可以产生分子机制和信号传导通路在胚胎发生8，9的线索。事实上，该方法被应用于naa10植物，它被发现的突变体中垂体异常分裂可能引起胚胎发生5年间，生长素分布的变化。
Protocol
Representative Results
Discussion
胚珠间隙是种有用的检测细胞分裂和评估拟南芥; 在胚胎发生过程中的形态学方法使用这种技术，可以直接在 DIC 显微镜5，12下观察到胚。胚珠间隙关键的一步是一步 1.3.4。胚珠间隙 1.3.4 步骤中所需的时间是变量。2/4-细胞阶段的胚胎可以清楚地观察后 2 h 在霍耶的解决方案中，，而在 12 小时后，他们看隐隐绰绰。因此，越成熟的胚珠是，清关所?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢杰西卡 · 哈巴希博士批判性阅读的手稿。我们感谢成像中心，首都师范大学 （中国北京），生命科学学院博士白先勇盛执行dr5 的表达绿色荧光蛋白测定的定位。这项工作由从北京市政政府科学基金会赠款 (CIT & TCD20150102) 和中国国家自然科学基金会 (31600248)。
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
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