Zuivering van het membraan compartiment voor endoplasmatisch Reticulum-geassocieerde afbraak van exogene antigenen in Cross-presentatie

De MHC ik moleculen worden uitgedrukt op het oppervlak van alle genucleëerde cellen, met korte antigene peptiden afgeleid van endogene antigenen, die worden verwerkt door het systeem van de ubiquitin-proteasoom in het cytosol¹. Na verwerking, worden antigene peptides vervoerd in het lumen van het endoplasmatisch reticulum (ER) door de peptide vervoerder TAP. In de ER lumen, een aantal specifieke chaperones helpen het peptide laden en de juiste vouwen van de MHC ik complexe. Deze serie van moleculen heet het peptide-laden complex (PLC), waarmee wordt aangegeven dat ER een centrale compartiment voor peptide laden op MHC ik². Na peptide laden, het MHC ik moleculen naar het celoppervlak worden vervoerd en een sleutelrol spelen in het adaptieve immuunsysteem als zelfstandige markeringen, en stelt de CD8⁺ cytotoxische T-lymfocyten (CTL’s) kankercellen of infectieuze agentia op te sporen door antigene peptiden van niet-zelf eiwitten³.

Antigeen presentatie van cellen (APC), antigene peptiden van exogene antigenen ook in zijn gepresenteerd op MHC ik^4,5,6,7,8 via CP, die voornamelijk wordt uitgevoerd door DCs^9,10,11. CP is essentieel zowel voor de activering van naïeve CD8⁺ T cellen en geheugen CD8⁺ T cellen in anti-infectieuze en anti-tumoral CTL’s^12,13, en in het onderhoud van immuun tolerantie door het inactiveren van zelf waarnemend naïef T cellen^14,15. De CP speelt veel belangrijke rollen in het adaptieve immuunsysteem, maar de moleculaire mechanismen van CP nog moeten in detail worden beschreven. Eerdere studies van CP bleek dat exogene antigenen waren gelokaliseerd, zowel in de ER en de endosome en werden verwerkt door ERAD, suggereren dat exogene antigenen van de endosome worden vervoerd naar de ER voor ERAD-achtige verwerking en peptide laden¹⁶ . Accumuleren bewijsmateriaal blijkt evenwel dat het laden van de peptide van CP wordt uitgevoerd niet in het ER maar in niet-klassieke endocytotische compartimenten, die ook kenmerken van de ER (Figuur 1)^{17,18 hebben ,19,20,21}. Voorkom aantasting van de voorlopers van de antigene peptide door de hoge activiteit van aminopeptidase²² in het cytosol, de verwerking en de peptide laden in CP treedt op in het proximale gebied voor deze niet-klassieke endocytotische compartimenten (Figuur 1). Hoewel de karakteristieken van deze endocytotische compartimenten controversieel zijn, zijn er geen bestaande specifieke moleculen dan exogene antigenen in dit compartiment.

ERAD is een cellulaire traject, waarbij specifiek misfolded eiwitten uit de ER wordt verwijderd. In het traject ERAD zijn misfolded eiwitten retrogradely via het membraan ER naar het cytoplasma getransporteerd en verwerkt door de ubiquitin-proteasoom systeem^23,24,25. Wanneer grote moleculen, zoals eiwitten, worden vervoerd via de lipide dubbelgelaagde, deze moleculen passeren aan een moleculaire apparaat genaamd een translocon, zoals het Sec61 complex, Derlin complex in de ER²⁶, en de complexe Tom en Tim complex in de mitochondriën²⁷. Wanneer exogenously toegevoegde antigenen via het ER membraan worden getransporteerd, moeten zij de lipide dubbelgelaagde in complex met translocons, zoals het Sec61-complex doordringen. De hier beschreven methode gezuiverd de gerichte blaasje door gebruik te maken van deze membraan-penetrating moleculen als markers voor de endocytotische compartimenten.

De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel zuivering protocol met behulp van de DC-achtige cel lijn DC2.4²⁸ en biotinyleerd ovoalbumine (bOVA) als een exogene antigeen. De endocytotische compartimenten werden gezuiverd door daar (SA)-magnetische kralen met behulp van de membraan-penetrating bOVA als een maker. In deze gezuiverde microsome, enkele exogenously toegevoegd bOVA was nog steeds bewaard in het membraan breuken maar werden vervoerd naar de buitenkant van de microsome, en dan ubiquitinated en verwerkt in vitro²⁹. Deze gezuiverde microsome gegevens opgenomen, niet alleen de endocytotische compartiment-specifieke eiwitten, maar ook ER-ingezeten eiwitten voor ERAD en de peptide laden complex; suggereert dat het cellulaire compartiment het potentiële endocytotische compartiment voor CP^{29 is}. Dit protocol is niet afhankelijk van het soort exogene antigenen, en geldt ook voor andere deelverzamelingen van DC en andere celtypen, zoals macrofagen, B-cellen en endotheliale cellen, ter verduidelijking van de precieze moleculair mechanisme van DCs voor bedreven CP.