В этом протоколе описаны этапы клонирования нескольких однонаправленных РНК в один направляющий вектор-конкатенатор РНК, который особенно полезен при создании нокаутов с несколькими генами с использованием технологии CRISPR / Cas9. Появление двойных нокаутов в органоидах кишечника показано как возможное применение этого метода.
Технология CRISPR / Cas9 значительно улучшила осуществимость и скорость исследований потери функции, которые необходимы для понимания функции генов. У более высоких эукариот паралогичные гены могут маскировать потенциальный фенотип, компенсируя потерю гена, тем самым ограничивая информацию, которая может быть получена из генетических исследований, основанных на выпадениях одного гена. Мы разработали новый метод быстрого клонирования направляющих конъюгатов РНК (gRNA), чтобы создать многоцелевые нокауты после одного раунда трансфекции в небольших органных клетках мыши. Наша стратегия позволяет конкатмеризовать до четырех отдельных gRNAs в один вектор, выполняя одну реакцию Shuffling Golden Gate с отожженными олигонами gRNA и предварительно разработанным ретровирусным вектором. Это позволяет либо одновременный нокаут до четырех разных генов, либо повысить эффективность нокаута после нацеливания одного гена несколькими гРНК. В этом протоколе мы подробно показываемКак эффективно клонировать несколько гРНК в ретровирусный вектор CRISPR-concatemer и как добиться высокоэффективной электропорации в кишечных органоидах. В качестве примера мы показываем, что одновременный нокаут двух пар генов, кодирующих отрицательные регуляторы сигнального пути Wnt (Axin1 / 2 и Rnf43 / Znrf3), делает кишечные органоиды устойчивыми к отмене ключевых факторов роста.
Обратный генетический подход является широко используемым методом исследования функции гена. В частности, исследования потери функции, в которых разрушение гена вызывает фенотипические изменения, играют ключевую роль в построении нашего понимания биологических процессов. Метод CRISPR / Cas9 представляет собой последнее усовершенствование в технологии технологии генома и революционизировал существующую практику генетики в клетках и организмах. Cas9 представляет собой эндонуклеазу с РНК-направленностью, которая связывается с определенной последовательностью ДНК, комплементарной гРНК, и генерирует двухнитевый разрыв (DSB). Этот DSB рекрутирует устройство для восстановления ДНК, которое в отсутствие шаблона ДНК для гомологичной рекомбинации будет повторно лигировать вырезанную ДНК-цепь с помощью ошибочного гомологичного концевого соединения, что, таким образом, может привести к вставкам или делециям нуклеотидов (нуклеотидов) Вызывая мутации в рамке 1 .
Большая легкость и универсальность CRISPR / Cas9 apprOach сделала его очень привлекательным инструментом для экранов с ножом для генома, направленных на распутывание неизвестных функций гена 2 , 3 . Тем не менее, подходы с одним нокаутом генов имеют ограниченное применение, если существуют множественные паралоги с избыточными функциями. Таким образом, удаление одного гена может быть недостаточным для определения функции этого гена при возможной компенсации паралогами, что приводит к незначительному или отсутствующему фенотипическому изменению 4 . Поэтому важно параллельно выбивать параллели, поставляя несколько векторов gRNA, нацеленных на различные паралоговые гены, чтобы преодолеть влияние генетической компенсации.
Чтобы расширить использование CRISPR / Cas9 для нокаута паралогого гена, в последнее время мы разработали быстрый способ однократного клонирования для клонирования до четырех предварительно отожженных gRNAs в один ретровирусный вектор 5 . Основа, называемая CRISPR-concatemer, основанаНа ретровирусной плазмиде MSCV, содержащей повторяющиеся кассеты экспрессии gRNA. Каждая кассета содержит два перевернутых участка распознавания рестрикционного фермента типа IIS Bbs I, который может быть необратимо заменен отожженным олигоном gRNA с соответствующими свесами с использованием реакции перетасовки золотых ворот в одной пробирке 6 . Этот метод клонирования состоит из повторяющихся циклов пищеварения и лигирования, которые позволяют одновременную сборку нескольких фрагментов ДНК путем использования различных последовательностей навесов, генерируемых Bbs I. Уникальность этого фермента заключается, например, в возможности выполнять асимметричные срезы за пределами его распознавания последовательность; Поэтому каждая кассета может иметь различную последовательность с индивидуальными выступами, фланкирующими сайт Bbs I, и таким образом, каждая gRNA может быть клонирована в определенном положении и ориентации вектора конкатематора.
В качестве доказательства принципа мы продемонстрировали использование этой стратегии вМышечных органоидов кишечника, одновременно разрушая две пары паралогичных отрицательных регуляторов пути Wnt одним кругом электропорации 5 .
В течение последних нескольких лет многие другие группы разработали аналогичные стратегии, основанные на множественных векторах экспрессии gRNA, построенных с использованием перетасовки 7 « Золотых ворот», для достижения нокаута нескольких генов в различных модельных системах, таких как клеточные линии 8 , 9 , рыбок данио 10 и Escherichia coli 11 . В своих протоколах gRNAs сначала клонируются в отдельные промежуточные векторы и затем собираются вместе в один конечный продукт. Напротив, основным преимуществом нашей стратегии CRISPR-concatemer является удобство единственного шага по BBS I, клонирование. Как и другие конкатэмеры gRNA, наш метод позволяет либо одновременный нокаут до четырехРазличные гены или повышенную эффективность нокаута CRISPR после нацеливания одного или двух генов с множественными гРНК ( рис. 1 ).
В этом протоколе мы подробно описываем каждый шаг в генерации векторов CRISPR-конкатэмера, от проектирования gRNA до реакции «Золотые ворота» и подтверждения успешного клонирования. Мы также предоставляем высокоэффективный протокол для трансфекции CRISPR-конкатемеров в мышиные малые кишечные органоиды путем электропорации и последующих экспериментов по выводу фактора роста.
В этом протоколе мы подробно изложим все шаги, необходимые для создания CRISPR-конкатэмеров и применения CRISPR-конкатемеров в органоидах кишечника мыши, чтобы одновременно выбить несколько генов. Как отмечалось ранее, эта стратегия имеет ряд преимуществ, таких как ее скорость, высокая эффективность и экономичность.
Чтобы успешно выполнить всю процедуру, необходимо рассмотреть несколько важных аспектов. Во-первых, важно, чтобы все олигоны gRNA были надлежащим образом отожжены и фосфорилированы, поскольку они представляют собой исходный материал для реакции клонирования Bbs I, который сам по себе является очень эффективным. Во-вторых, когда электропорация органоидов, чем больше клеток используется для каждого состояния, тем выше максимальная эффективность трансфекции. Кроме того, важно также, что после диссоциации клеток мелкие клеточные кластеры преобладают над отдельными клетками.
Тем не менее, можно встретить технические проблемыЛемы при попытке либо клонирования, либо трансфекции в первый раз; В случае проблем при клонировании гРНК рекомендуется дважды проверить последовательность олигонуклеазы gRNA и, если правильно, выбрать дополнительные колонии бактерий для скрининга с рестрикционным расщеплением. Если эффективность трансфекции и жизнеспособность клеток являются низкими после электропорации, тогда желательно повторить протокол, используя большее количество клеток для каждого состояния и уменьшая время диссоциации клеток до 3 мин.
Хотя генерация CRISPR-конкатемеров относительно дешева и легка, использование крупномасштабных генетических экранов в органоидах не является, поскольку масштаб ограничен расходами, связанными с органоидной культурой и ее трудоемким характером. В этом случае стоит упомянуть, что метод CRISPR-concatemer также совместим с клеточными линиями, такими как HEK293 и эмбриональные стволовые клетки мыши.
Независимо от сотовой системы, другой потенциальный недостаток этогоTrategy можно встретить при одновременном выбивании трех или четырех разных генов. Например, каждая gRNA будет иметь различную эффективность таргетинга и изменения попадания всех генов в одно и то же время могут быть относительно низкими; По этой причине целесообразно использовать систему конкатэмеров для направления более одной гРНК против одного и того же гена.
На протяжении многих лет были предложены альтернативные стратегии, аналогично основанные на перетасовке «Золотых ворот» для генерации мультиплексных векторов gRNA 7 , 8 . Однако в нашем методе можно сразу собрать несколько gRNAs в один ретровирусный вектор за один раунд клонирования, что делает его пригодным для генерации библиотек gRNA для нацеливания на паралоги.
Наш CRISPR-конкатэмер построен в ретровирусной векторной магистрали MSCV. Таким образом, gRNA-конкатемпер-содержащий ретровирус может быть использован для генерации стабильных клеточных линий, которые перегружаютRess gRNAs. В сочетании с Cas9-индуцируемой системой можно использовать индуцируемые паралогические нокауты с использованием нашей системы.
Вкратце, здесь мы опишем, как клонировать до четырех разных gRNAs в один и тот же вектор за один шаг и как применять эту стратегию к органоидной культуре с высокой эффективностью трансфекции. Кроме того, мы предлагаем полезные предложения, чтобы максимизировать шансы на успех на протяжении всей процедуры.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Кристофера Хиндли за критическое чтение рукописи. AM поддерживается Wntsapp (Marie Curie ITN), AA-R. Поддерживается Советом медицинских исследований (MRC) и BK.K. И RM поддерживаются стипендией сэра Генри Дейла из Wellcome Trust и Королевского общества [101241 / Z / 13 / Z] и получают поддержку через основной грант от Wellcome Trust и MRC до Wellcome Trust – MRC Cambridge Stem Cell Institute ,
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Plasmid mini kit | Qiagen | 12125 | |
Table top microcentrifuge | Eppendorf | UY-02580-01 | |
Inoculating loops | Microspec | PLS5 | |
Bacteria incubator | Sanyo | MIR-262 | |
Luria-Bertani broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
Agarose gel electrophoresis apparatus | Bioneer | A-7020 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 µg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 µg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Y-27632 10 µM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium ) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |