CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

1. CRISPR-concatemer 벡터를위한 gRNA 디자인 참고 :이 섹션의 목적은 최상의 표적 전략을 선택하는 방법과 CRISPR-concatemer 벡터에 특정 돌출부가 포함 된 gRNA를 설계하는 방법을 설명하는 것입니다. 선택한 CRISPR gRNA 디자인 도구를 사용하여 관심 유전자에 대한 gRNA를 설계하십시오. 예제는 표를 참조하십시오. 참고 : 한 쌍의 평행 유전자를 표적으로 할 때 유전자 당 하나의 gRNA를 디자인 할 수는 있지만 유전자 당 2 개의 gRNA를 설계하여 이중 녹아웃을 달성 할 가능성을 높여야합니다 ( 그림 1 ). gRNAs이 제한 매핑 도구 (예를 들어 재료의 표 참조)을 사용하여 BBS I 인식 부위를 포함하지 않는 확인하십시오. 표 1 과 같이 각 oligo에 특정 CRISPR-concatemer 벡터 돌출부를 추가합니다. "fo : keep-together.within-page ="1 "fo : keep-with-next.within-page ="always "> 카세트 1 카세트 2 카세트 3 카세트 4 서열 (5'-3 ') CACCGG [gRNA1] GT ACCGG [gRNA2] G CCGG [gRNA3] ACACCGG [gRNA4] GTT 서열 (5'-3 ') TAAAAC [RC-gRNA1] CC AAAAC [RC-gRNA2] C AAAC [RC-gRNA3] CTAAAAC [RC-gRNA4] CCG 표 1 : CRISPR-concatemer 벡터의 각 카세트에 대한 오버행. 2. CRISPR-concatemer 벡터에 gRNA의 클로닝 올리고의 인산화 및 어닐링 참고 :이 단계는 어떻게 to 각 gRNA 올리고에 대해 상단 및 하단 가닥을 어닐링하고 단일 반응으로 말단을 인산화시키는 방법. 아래 지침에 따라 올리고를 인산화시키고 상 및 하부 가닥을 어닐링하기위한 반응 혼합물을 준비하십시오. 참고 : 모든 올리고는 하나의 반응으로 모아 둘 수 있습니다. 예를 들어, 4 gRNA- 연결자 벡터의 경우, 8 개의 올리고 (oligos)를 함께 모으십시오. 3 concatemers 들어, 3.0 μL gRNA 상단 가닥 (각 gRNA에서 10 μM, 1 μL / gRNA 1.0 μL), 3.0 μL gRNA 하단 가닥 (각 gRNA에서 1.0 μL, 10 μM, 1 μL / gRNA), 2.0 μL T4 DNA 리가 아제 완충액 (10 배), T4 PNK 1.0 μL, 20.0 μL의 총 부피까지 H 2 O에 추가. pipetting하여 잘 혼합하고 다음 설정을 사용하여 thermocycler에서 이것을 실행하십시오 : 37 ° C 30 분, 95 ° C 5 분, 25 ° C에서 0.3 ° C / min으로 낮추십시오. 4 ° C. Bbs 나는 반응을 뒤섞었다. 참고 :이 섹션에서 사전 어닐링 된 gRNA 올리고는 소화 및 연결의주기를 번갈아 가며 한 단계로 연결 벡터의 적절한 위치에 통합됩니다. 반응 혼합물을 DNase / RNase가없는 물에서 1 : 100으로 희석하여 3 및 4 gRNA- 연결자 벡터를 생성한다. 참고 : 2 gRNA-concatemers를 복제 할 때이 단계가 필요 하지 않습니다. 아래 지침에 따라 Bbs I 반응을 얼음 위에서 섞는다 . 벡터 만 포함하는 부정적인 컨트롤을 포함시킵니다. 100 ng CRISPR- concatemer 벡터, 10.0 μL oligo 혼합물, 1.0 μL BSA 함유 제한 효소 버퍼 (10X), 1.0 μL DTT (10 MM), 1.0 μL ATP (10 MM), 1.0 μL BBS I, 1.0 μL T7 리가 제 20.0 μL 총량 이하, 및 H 2 O. pipetting하여 잘 섞어 다음과 같은 설정을 사용 thermocycler에서 이것을 실행 : 3과 4 gRNA – concatemers를 복제하기 위해 50 사이클 을 실행하고 <strong> 5 분, 5 분, 21 ° C, 37 ° C에서 2 gRNA-concatemers, 모두 25 사이클, 15 분 동안 37 ℃에서 유지 한 후 39 ° 영원히 하였다. 엑소 뉴 클레아 제 처리 참고 :이 단계는 선형화 된 DNA의 흔적을 제거하여 복제 효율성을 높이므로 권장됩니다. Bbs I 반응을 다음과 같이 DNA exonuclease ( 물질 표 참조)로 처리하십시오. 이전 단계 (2.2.3)에서 11.0 μL 연결 믹스를 취하고 1.5 μL 엑소 뉴 클레아 어 완충액 (10X), 1.5 μL ATP (10 MM), 1.0 μL DNA 엑소 뉴 클레아 제를 첨가하고 총 부피를 물로 15.0 μL로 증가시킵니다. 30 분 동안 70 ° C로 30 분 동안 37 ° C에서 품어 낸다. 참고 :이 단계는 혼합물에 잔류하는 선형화 된 DNA를 제거하므로 복제 효율이 높아집니다. 2 μL의 반응 혼합물을 사용하여 화학적으로 변성시킨다.열충격에 의한 텐트 E. 대장균 12 . 참고 : 또는 반응은 -20 ° C에서 최대 1 주일 동안 보관할 수 있습니다. 제한 소화 참고 :이 단계의 목적은 제한 효소 절단으로 클로닝 절차의 성공 여부를 평가하는 것입니다. CRISPR – concatemer 벡터에 gRNA 삽입의 존재를 확인하기 위해 접종 루프와 4 – 8 박테리아 식민지를 선택하고, 궤도 진탕 전자에서 37 ° C 밤새 4 ML LB 매체의 각 클론을 성장. 제조 업체의 지침에 따라 플라스미드 miniprep 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다 ( 재료 표 참조). 박테리아 배양기에서 3 시간 동안 37 ° C에서 배양하여 10 μL 반응에서 10 U EcoR I + 5 U Bgl II로 DNA 200 ng을 소화합니다. 크기 비교를위한 양성 대조군으로서 상응하는 원 벡터와 별도의 반응 혼합물을 포함시킨다. 참고 : Thi이 두 가지 제한 효소가 전체 concatemers를 소비하기 때문에 모든 concatemers가 있는지 여부를 확인합니다. 각 concatemer의 예상 크기는 2 gRNA concatemer (800 bp), 3 gRNA concatemer (1.2 kbp) 및 4 gRNA concatemer (1.6 kbp)입니다. 90 %에서 약 20 분 1 % 아가로 오스 겔에서 소화 반응을 실행합니다. UV Transilluminator를 사용하여 젤을 시각화하십시오. 밴드 패턴이 원래 벡터 중 하나와 일치하고 각 조각이 DNA 사다리를 사용하여 예상되는 크기를 갖도록하여 삽입 크기가 올바른 클론을 식별합니다. 선택한 클론을 5 U Bbs I로 37 ℃에서 3 시간 동안 박테리아 배양기에서 소화시킵니다. 해당 원래 벡터와 별도의 반응 믹스를 컨트롤로 포함시킵니다. 참고 :이 추가 분해 단계는 gRNA가 올바른 위치에 클로닝되어 결과적으로 모든 Bbs I 인식 사이트가 손실되었음을 확인하는 것입니다. 에 소화 반응을 실행하십시오.약 20 분 동안 90V에서 1 % 아가 로즈 겔. 그들은 단지 gRNAs을 포함하기 BBS I에 의해 절단되지 않는 등 올바른만을 벡터를 고려하십시오. 벡터 시퀀싱 참고 :이 단계의 목적은 제한 효소 분석으로 올바른 것으로 확인 된 벡터에서 gRNA 염기 서열의 존재를 확인하는 것입니다. 다음 프라이머를 사용하여 Sanger sequencing 13에 의해 양성 concatemer vector를 확인하십시오 : 앞으로 : TCAAGCCCTTTGTACACCCTAAG (첫 번째 gRNA 카세트 확인) Linker1_Forward : GACTACAAGGACGACGATGACAA (두 번째 gRNA 카세트 확인 용) Linker2_Reverse : GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGT (두 번째 gRNA 카세트 확인 용) Linker2_Forward : ACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC (세 번째 gRNA 카세트 확인 용) Linker3_Reverse : TCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCAT (세 번째 gRNA 카세트 확인 용) Reverse : AGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAG (마지막 gRNA 검사 용)카세트) sequencing reading에서 서열을 검색하여 모든 gRNA의 존재를 확인하십시오. 3. 일렉트로 포 레이션에 의한 장관 Organoids의 Transfection 참고 :이 절차는 Fujii 등이 게시 한 프로토콜을 기반으로합니다. 2015 년에 마우스 소장 조직 세포 배양에 적응 14 . 사전 전기 천공 법 참고 :이 섹션에서는 모든 항생제와 컨디셔닝 된 배지를 배양 배지에서 제거하여 전기 천공하기 전에 마우스의 장관 유기체를 준비하는 방법을 설명합니다. 이것은 electroporation 동안 가능한 독성 효과를 방지합니다. 형질 감염 과정의 0 일째에, 1 : 2의 비율로 유기체를 분리한다. 참고 : 장 organoid 문화는 이전에 설립 프로토콜 15 에 따라 암호 격리를 수행하여 얻을 수 있습니다. 참고로 <st모든 미디어 구성에 대해 표 2. electroporation에 대한 organoids을 분할하면, transfection 당 48 웰 플레이트의 최소한 6 우물을 씨앗. 20 μL 지하실 행렬 떨어진다 organoids를 시드 및 37 ° C에서 WENR + 닉 매체 (의 Wnt + EGF + 소량 + R-spondin + 니코틴)에서 그들을 성장, 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2 (같이 이전 15 기재) . 2 일째, WENR + Nic을 항생제가없는 EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (Glycogen Synthase Kinase-3 억제제) + Y-27632 (ROCK 억제제) 250 μL로 교체하여 배지를 교환하십시오 ( 표 2 참조). 참고 : 모든 단계에서 48 웰 플레이트의 각 웰에 첨가되는 배지의 양은 250 μL입니다. 3 일째, 항생제가없는 유기물 배지를 EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25 % v / v 디메틸 술폭 사이드 (DMSO)로 바꾼다. 세포의 준비 노트:여기서 우리는 기계적 및 화학적 해리에 의해 유기체를 작은 세포 클러스터로 파쇄하는 방법을 설명합니다. 이러한 단계는 절차의 성공에 중요합니다. 4 일째, 1 ML 피펫 팁 및 1.5 mL 튜브에 organoids를 전송을 사용하여 지하 매트릭스 돔을 방해. 48- 웰 플레이트의 4 개 웰의 내용물을 튜브에 넣습니다. P200 피펫으로 위 아래로 약 200 회 피펫 팅하여 유기체를 기계적으로 작은 조각으로 나눕니다. 실온에서 원심 분리기, 600 x g에서 5 분. 배지를 제거하고 세포 배양 등급 재조합 프로 테아 제 1 mL의 펠렛을 재현 탁하십시오 (물질 표 참조). 최대 5 분 37 ° C에서 품어 다음 4X 목적으로 거꾸로 빛의 현미경에서 샘플의 50 – μL 드롭을 확인하십시오. 참고 : electroporation 후 셀 생존을 증가 10-15 세포의 클러스터가 바람직합니다. 세포 현탁액을 낮은 바인딩 15 ML 튜브에 전송하고 중지항생제가없는 기초 배지 9 mL를 첨가하여 해리시켰다 ( 표 2 참조). 실온에서 600xg로 5 분간 원심 분리 한 후 상층 액을 버리고 환원 된 혈청 배지 ( 표 2 참조) 1 mL에 펠렛을 재현 탁한다. Bürker의 챔버로 세포 수를 세고 electroporation 반응 당 최소 1 x 10 5 세포를 사용하십시오. 9 mL의 환원 된 혈청 배지를 15 mL 튜브에 넣고 실온에서 400 x g에서 3 분간 원심 분리한다. 일렉트로 포 레이션 참고 : 다음 섹션에서는 electroporation을 수행하고 이후 organoid를 복구하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 뜨는 모든 것을 제거하고 electroporation 솔루션 ( 재료의 테이블을 참조)에서 펠렛을 resuspend. 세포 현탁액에 10 μg DNA 총 금액을 추가하고 100 μL의 최종 볼륨 electroporation 솔루션을 추가하고 세포 DN을 유지얼음 혼합물. Cas9 발현 플라스미드 ( 예 : Addgene # 41815)와 CRISPR- concatamer 벡터를 1 : 1 비율로 사용하십시오. 참고 : 첨가 된 DNA의 총 부피는 총 반응 부피의 10 % 이하 여야합니다. 형질 감염 효율 ( 예 : pCMV – GFP, Addgene # 11153, 또는 일반 GFP – 표현 플라스미드)을 평가하기 위해 GFP 플라스미드를 포함하는 별도의 트랜 스펙 션 믹스를 포함하십시오. 세포 – DNA 혼합물을 electroporation 큐벳에 추가하고 electroporator 챔버에 놓으십시오. 일렉트로 포터에있는 해당 버튼을 눌러 임피던스를 측정하고 0.030-0.055 Ω인지 확인하십시오. 표 3 에 나와 있는 설정에 따라 electroporation을 수행하십시오. 참고 : 임피던스 값이 허용 범위를 벗어나는 경우 큐벳의 용액 부피를 조정하십시오. 큐벳에 electroporation 버퍼 + Y – 27632 400 μL를 추가하고 모든 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. Incubate를 실온에서 30 분간 처리하여 세포가 회복되도록 한 다음 실온에서 400 x g에서 3 분간 그들을 회전시킨다. 뜨는을 제거하고 지하 매트릭스 20 μL / 잘에서 펠렛을 resuspend. 48 웰 플레이트에 웰 당 약 1 x 10 4 내지 1 x 10 5 세포를 접종하고 EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25 % v / v DMSO 배지를 첨가한다. 37 ° C에서 배양하십시오. 5 일째, 매체를 EN + CHIR99021 + Y-27632로 변경하고 GFP 발현을 관찰하여 형질 감염 효율을 확인하십시오 ( 그림 2 ). 유기체를 37 ° C에 유지하고 2 일 후에 EN + CHIR99021 + Y-27632 배지를 새로 고칠 것. 9 일에, 매체를 WENR + Nic + Y-27632로 바꾸고 37 ° C에서 배양하십시오. 참고 : Y-27632는 7-10 일 후 (16-19 일)에 제거 할 수 있습니다. 펄스 맥박 </strong> 전송 펄스 전압 175V 20V 펄스 길이 5 밀리 초 50msec 맥박 간격 50msec 50msec 펄스 수 2 5 감쇠율 10 % 40 % 극성 + +/- 표 3 : 일렉트로 포 레이션 설정. 4. 성장 인자 철수 주 : 여기에서는 장 기관에서 Wnt 경로의 음성 조절 인자를 녹아웃시킬 때 성장 인자 회수 실험을 수행하는 방법을 예시한다. 10-14 일 후에r electroporation은 위에서 언급 한 단계 (3.2.1 – 3.2.2)에 따라 48 – 웰 플레이트에서 1 : 3 비율로 organoids를 분할. 기저막 매트릭스의 20 μL에 organoid 펠렛을 Resuspend하고 10 분 동안 37 ° C에서 응고시키다. 다음에, 성장 인자를 박탈 매체 오버레이 250 μL (예를 들어 EN)는 표적 유전자의 녹아웃 5 달성되었는지의 여부를 테스트한다. 야생형 야생형 (WT) 조절 유기체와 돌연변이 체 유기체 사이의 생존 차이를보기 위해 최소 2 ~ 3 계대의 성장 인자가 박탈 된 조건에서 유기체를 분리하십시오 5 , 15 . 참고 : wildtype organoid는 2 계대 이상의 성장 인자가 결핍 된 배지에서 살아남아서는 안되며 돌연변이 체는 자랄 수 있어야합니다.