Özet

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Published: November 06, 2017
doi:

Özet

ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل واستزراع الماوس الأساسي الحبيبية الدماغي الخلايا العصبية (كنس) من يوم 6-7 القديمة الجراء، كفاءة توصيل لكنس للخسارة والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة excitotoxicity الخلايا العصبية التي يسببها نمدا، موت الخلايا التي يسببها البوتاسيوم منخفضة وتلف الحمض النووي، والأكسدة باستخدام نفس نموذج الثقافة.

Abstract

الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية (كنس) نموذج العصبية شيوعاً، تشكل نسبة سكان متجانسة وفيرة في المخيخ. وفي ضوء التنمية اللاحقة للولادة، ووفرة، وإمكانية الوصول، كجنس نموذجا مثاليا دراسة العمليات العصبية، بما في ذلك تنمية الخلايا العصبية والهجرة العصبية، وتحفيز نشاط الخلايا العصبية الفسيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، تقدم الثقافات CGN نموذجا ممتازا لدراسة أوضاع مختلفة لموت الخلية بما في ذلك اكسسيتوتوكسيسيتي والمبرمج. في غضون أسبوع في الثقافة، أعرب كنس مستقبلات ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا)، مستقبل غلوتامات إيونوتروبيك محددة مع العديد من الوظائف الحيوية في الخلايا العصبية في الصحة والمرض. استخدمت إضافة تركيزات منخفضة من نمدا بالاقتران مع غشاء ديبولاريزيشن للقوارض الثقافات CGN الأولية لنموذج تحفيز نشاط الخلايا العصبية الفسيولوجية في حين يمكن أن تستخدم إضافة تركيزات عالية من نمدا لنموذج إصابة الخلايا العصبية اكسسيتوتوكسيك. هنا، يتم وصف طريقة العزل واستزراع لكنس من الجراء يوم 6 من العمر، فضلا عن التلاعب بالجينات لكنس غدية ولينتيفيروسيس. ونحن أيضا هذه البروتوكولات الأمثل في كيفية حفز المستحثة نمدا excitotoxicity والمبرمج التي يسببها البوتاسيوم منخفضة، والأكسدة وتلف الحمض النووي بعد توصيل هذه الخلايا العصبية.

Introduction

الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية (كنس) تتسم أيضا بالثقافة، وكانت بمثابة نموذج فعال لدراسة موت الخلايا العصبية والتنمية 1،2،3،،من45، 6-التعبير المبكر عن مستقبلات ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا) في CGN الثقافات في المختبر يجعلها نموذجا جذاباً للدراسة التي يسببها نمدا الإشارات. تفعيل هذه المستقبلات مع نمدا بالاقتران مع depolarization غشاء يستخدم نموذج تحفيز نشاط الخلايا العصبية الفسيولوجية ل، وسمح للبحث في آليات اللدونة متشابك 7،8. على العكس من ذلك، يمكن استخدام التحفيز المفرط لهذه المستقبلات التي يجند نمدا لنموذج اكسسيتوتوكسيسيتي، إليه رئيسية لفقدان الخلايا العصبية في الأمراض تلف المخ والأعصاب الحاد 9. إليه واحدة لاستحثاث excitotoxicity عن طريق التجويع ATP مع انخفاض الأكسجين، كما رأينا مع إصابة الخلايا العصبية الحادة. هذه النتائج في غشاء ديبولاريزيشن والإفراج عن مستويات مرتفعة من الغلوتامات في المشبك. أوفيرستيموليشن اللاحقة من مستقبلات NMDA بنتائج غلوتامات مرتفعة في المفرط Ca2 + التدفق عبر هذه المستقبلات، الذي بدوره يقوم بتنشيط مسارات عدة بما في ذلك Ca2 +-تفعيل البروتياز، فوسفوليباسيس، و اندونوكليسيس، أدى إلى التدهور غير المنضبط من المكونات الخلوية الحرجة وموت الخلايا. عالية داخل الخلية Ca2 + بالإضافة إلى ذلك، يؤدي إلى توليد الجذور الحرة الأكسجين وتلف الميتوكوندريا 10،11.

بينما غالبية فقدان الخلايا العصبية بعد اكسسيتوتوكسيسيتي الخلايا العصبية التي يسببها نمدا هو بسبب تدفق الكالسيوم وهو باكس/باك مستقلة، لا يمكن استبعاد آليات أخرى لموت الخلايا من هذا الطراز. مظهر كل نخرية وأبوبتوتيك مثل موت الخلايا بسبب اكسسيتوتوكسيسيتي جزئيا نتيجة لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) والحمض النووي الضرر الناجم عن ارتفاع داخل الخلية Ca2 + مستويات 12. أضرار الحمض النووي يؤدي موت الخلايا العصبية من خلال آليات أبوبتوتيك، الذي يرتبط بالسمات المميزة لموت الخلية أبوبتوتيك، مثل مظهر الكروماتين الجماهير والهيئات أبوبتوتيك. التعريفي للمبرمج هو بوساطة من خلال إطلاق سراح ج الفسفرة من الميتوكوندريا، وقد ثبت أن يكون معتمداً على باكس/باك أوليجوميريزيشن 13. أوليجوميريزيشن باكس/باك يعزز تشكيل المسام في غشاء الميتوكوندريا الخارجي، مما أدى إلى الإفراج ج الفسفرة وتفعيل المنظمين برو-أبوبتوتيك كما رأينا مع الإصابات الدماغية معتدل 14.

جيل روس قضية هامة في الدماغ بسبب انخفاض مستويات المواد المضادة للأكسدة، مقترنة بشرط الأوكسجين كبيرة ل أداء الخلايا العصبية 15الذاتية. عندما تتعرض لحدث الدماغية، هو أكسيد النيتريك synthase upregulated، إنتاج أكسيد النيتريك وزيادة الأنواع الأكسجين التفاعلية 14. يمكن أن ينتج عنه تلف الحمض النووي زيادة تركيز الأكسجين الجذور ويسبب مجاعة الطاقة غير مباشر. مستويات عالية من الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل فواصل يتم علاجها بتفعيل بولي ADP-الريبوز بولمرس-1 (نشطت-1)، بروتين الكروماتين زمنياً حقيقية النواة مسؤولة عن تحفيز نقل وحدات شرطة أبوظبي-الريبوز من NAD+، جزءا لا يتجزأ من عملية إصلاح الحمض النووي 16. بيد مع مفرطة الضرر نتيجة للأكسدة، التنشيط نشطت-1 يمكن أن يسبب مجاعة الطاقة نتيجة لنزوح زيادة على ند+، ركيزة اللازمة لإنتاج ATP عن طريق الفسفرة. في نهاية المطاف، الأكسدة سوف يؤدي المبرمج بطريقة تعتمد باكس/باك مما يؤدي إلى الفسفرة المتقدرية ج الإفراج، ولقد ثبت للحث على تغيير طراز الميتوكوندريا في كنس 17.

أخيرا، يمكن استخدام تغييرات في تركيز كلوريد البوتاسيوم (بوكل) في الثقافات CGN طراز منخفضة البوتاسيوم/depolarization وساطة المبرمج 18،،من1920. عندما تتعرض لمستويات منخفضة من ك+، كنس الخضوع التغييرات الفسيولوجية متميزة، أسفر عن تخفيض التنفس المتقدرية وتحلل، يعزى إلى انخفاض الطلب الخلوية 21، فضلا عن انخفاض في مستويات النووية عاملاً-κB (NFκB) الذي ينظم الأنشطة بما في ذلك الالتهاب وانتقال متشابك 22. هذا النموذج أهمية خاصة لدراسة موت الخلية أثناء تطوير الخلايا العصبية. البيئة ك+ منخفضة أوثق تشبه الظروف الفسيولوجية، ويتسبب في السمات المميزة لموت الخلايا شهد خلال الخلايا العصبية التنمية 23.

وباختصار، كنس نموذجا منذ أمد بعيد للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء موت الخلايا العصبية والانحطاط. سيسمح البروتوكول التالي العزلة واستزراع كنس أو التعبير أو القمع طريقا الوراثية خاصة باستخدام الفيروسات واستحثاث موت الخلايا العصبية عن طريق آليات مختلفة تمثل الإصابة العصبية والانحطاط.

Protocol

هو هذا البروتوكول على أساس إدخال تعديلات على الإجراءات التي تم وصفها سابقا 18 ، ، من 24 25 ، 26 ، 27-هذا البروتوكول هو أقرته “لجنة رعاية الحيوان” في جامعة ماكغيل. 1-“إعداد تجريبية” <p class="jove_…

Representative Results

مع تشريح دقيق، يجب إزالة الدماغ سليمة مع الحد الأدنى من الضرر كما هو مبين في الشكل 1 ألف-باء. ينبغي بذل جهد للحد من الأضرار في الدماغ أثناء الإزالة، ولا سيما الضرر الذي يلحق المخيخ. الأضرار المخيخ يجعل أكثر صعوبة تحديد وإزالة كاملة للسحايا، ويزيد ?…

Discussion

هنا نقدم طريقة بسيطة لاستزراع الماوس الأساسي الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية (كجنس)، وفقدان والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة آليات مختلفة لموت الخلايا. هناك عدة عوامل تؤثر على إمكانية تكرار نتائج النتائج باستخدام هذا الإجراء الذي يتطلب رصداً دقيقا. وتشمل هذه نقاء الثقافة بما في ذلك القضا?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا و “المعاهد الكندية للبحوث الصحية” المنح لجعفر-ألف.

Materials

qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2 VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

Referanslar

  1. Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
  2. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  3. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
  4. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  5. Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
  8. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
  9. Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
  10. Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
  11. Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
  12. Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
  13. Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
  14. Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
  15. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
  16. Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
  17. Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
  18. Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
  19. Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
  20. Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
  21. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  22. Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
  23. D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
  24. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
  25. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  26. Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
  27. Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
  28. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  29. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  30. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  31. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

View Video