与ChEC-seq的蛋白质-DNA相互作用的全基因组映射<em>酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）</em

映射转录因子（TF），染色质重组体和其他染色质相关调控因子的结合位点是理解所有基于染色质的过程的关键。虽然染色质免疫沉淀和高通量测序（ChIP-seq）方法已被用于获取对基因组生物学的许多重要见解，但它们具有显着的局限性。我们最近引入了一种替代方法，称为染色质内源性切割和高通量测序（ChEC-seq） ¹ ，以克服这些缺点。

最常使用初始甲醛交联步骤（X-ChIP-seq）进行ChIP-seq以保护蛋白质-DNA相互作用。然而，一些最近的研究表明，X-ChIP-seq捕获瞬时或非特异性蛋白质 – DNA相互作用2，3，4，5 ^，sup>， ^6，7，8 ，导致假阳性结合位点。此外，通常用于在X-ChIP-seq实验中分离染色质的超声处理，优先剪切开放染色质区域，导致片段从这些区域偏向恢复9,10。超声处理还产生片段长度的不均匀混合物，最终限制了结合位点分辨率，尽管加入外切核酸酶消化步骤可以极大地提高分辨率^11,12 。来自亲和纯化的天然分离染色质（ORGANIC） ¹³的基因组的占据区域的本地ChIP方法不使用交联和片段染色质与微球菌核酸酶（MNase），减轻与甲醛交联和超声处理相关的潜在偏差。然而，许多染色质结合蛋白在天然染色质提取所需的相对温和条件下的溶解性差，可能导致动态范围和/或假阴性减少¹⁴ 。

虽然ChIP-seq的各种迭代最常用于蛋白质-DNA相互作用的全基因组映射，但是还已经实现了基于目的蛋白质融合到各种DNA修饰酶的几种测绘技术。一种这样的方法是DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定（DamID） ¹⁵ ，其中感兴趣的染色质结合蛋白遗传融合到Dam，并且该融合在细胞或动物中表达，导致接近蛋白质结合位点的GATC序列的甲基化。 DamID的优点在于它不依赖于免疫沉淀，因此避免交联，抗体或染色质溶解。它也在体内进行 。然而，DamID的分辨率限于千碱基量表，Dam融合蛋白的甲基化活性是组成型的。基于酶融合的第二种方法是Calling Card-seq ¹⁶ ，其使用感兴趣因子融合转座酶，引导位点特异性整合转座子。像DamID一样，Calling Card-seq不是基于免疫沉淀，因此具有类似的优点，增加分辨率的附加益处。然而，呼叫卡-seq可能受到转座酶的序列偏差的限制，并且还依赖于接近转座子插入位点的限制性位点的存在。

在Laemmli实验室开发的第三种酶融合方法是染色质内源性切割（ChEC） ¹⁷ 。在ChEC中，染色质相关蛋白和MNase之间的融合物在细胞中表达，并且通过钙添加来活化MNase，DNA被切割到接近标记的结合位点因子（ 图1 ）。结合Southern印迹，ChEC已被用于表征17,18号酵母中多个单个位点的染色质结构和蛋白结合，并结合低分辨率微阵列分析来探测核孔组分与酵母的相互作用基因组¹⁹ 。 ChEC提供类似DamID和Calling Card-seq的优点，当通过引物扩展¹⁹进行分析时，其分辨率几乎为单碱基对。 ChEC也是可控的：MNase的强力DNA切割取决于加入毫摩尔钙，确保MNase在活酵母细胞中观察到的低游离钙浓度下是无活性的。

以前，我们假设将ChEC与高通量测序（ChEC-seq）相结合将提供TF结合位点的高分辨率图谱。事实上，ChEC-seq生成跨基因组¹的出芽酵母总调控因子（GRFs）Abf1，Rap1和Reb1的高分辨率^图 。我们还成功地将ChEC-seq应用于模块化Mediator复合体，这是一种保守的，重要的全局转录共激活因子²¹ ，扩大了ChEC-seq对不直接接触DNA的巨大体细胞复合物的适用性，可能难以通过ChIP-基于方法。 ChEC-seq是独立验证ChIP-seq结果和产生对染色质定位过程调节的新见解的有力方法。在这里，我们提出了一种在芽殖酵母中实施该方法的分步骤方案。