Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em> Saccharomyces cerevisiae</em

O mapeamento dos locais de ligação dos fatores de transcrição (TFs), remodeladores de cromatina e outros fatores reguladores associados à cromatina é fundamental para entender todos os processos baseados em cromatina. Embora as abordagens de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (ChIP-seq) tenham sido usadas para obter muitos pontos de vista importantes sobre a biologia do genoma, eles apresentam limitações notáveis. Introduzimos recentemente um método alternativo, denominado clivagem endógena de cromatina e seqüenciamento de alto rendimento (ChEC-seq) ¹ , para contornar essas desvantagens.

O ChIP-seq é mais frequentemente realizado com um passo inicial de reticulação de formaldeído (X-ChIP-seq) para preservar as interações proteína-DNA. No entanto, uma série de estudos recentes indicaram que X-ChIP-seq captura interações transiente ou inespecífica proteína-DNA ^{2 , 3 , 4 , 5} <Sup>, ^{6 , 7 , 8} , dando origem a falsos locais de ligação positiva. Além disso, a sonicação, comumente usada para fragmentar a cromatina em experimentos X-ChIP-seq, preferencialmente cisa regiões de cromatina aberta, levando a recuperação tendenciosa de fragmentos dessas regiões ^{9 , 10} . A sonicação também produz uma mistura heterogênea de comprimentos de fragmentos, limitando, em última instância, a resolução do local de ligação, embora a adição de um passo de digestão com exonuclease possa melhorar muito a resolução ^{11 , 12} . Os métodos ChIP nativos, tais como regiões ocupadas de genomas, de cromatina naturalmente isolada purificada por afinidade (ORGÂNICO) ¹³ não utilizam reticulação e fragmentação de cromatina com nuclease microcócica (MNase), aliviando vieses de potencial associadas à reticulação de formaldeído e sonicação. Contudo,A solubilidade de muitas proteínas ligadas à cromatina sob as condições relativamente suaves requeridas para a extração nativa da cromatina é fraca, potencialmente levando a uma redução do alcance dinâmico e / ou falsos negativos ¹⁴ .

Enquanto várias iterações de ChIP-seq são mais comumente usadas para mapeamento genômico de interações proteína-DNA, várias técnicas de mapeamento baseadas na fusão de proteínas de interesse para várias enzimas modificadoras de DNA também foram implementadas. Uma dessas abordagens é a identificação de DNA adenina metiltransferase (DamID) ¹⁵ , em que uma proteína de ligação à cromatina de interesse é geneticamente fundida em Dam e esta fusão é expressa em células ou animais, resultando em metilação de sequências de GATC proximais a locais de ligação para a proteína. DamID é vantajoso porque não depende da imunoprecipitação e evita a reticulação, os anticorpos ou a solubilização da cromatina. Também é realizado in vivo . Contudo, A resolução de DamID é limitada à escala de kilobase e a atividade de metilação da proteína de fusão de Dam é constitutiva. Um segundo método baseado na fusão enzimática é Calling Card-seq ¹⁶ , que emprega a fusão de um fator de interesse para uma transposase, direcionando a integração específica do site para os transposões. Como DamID, o Calling Card-seq não é baseado na imunoprecipitação e, portanto, tem vantagens semelhantes, com o benefício adicional de uma maior resolução. No entanto, Calling Card-seq pode ser limitado por viés de sequência das transposases e também depende da presença de locais de restrição próximos aos locais de inserção do transposão.

Um terceiro método de fusão enzimática, desenvolvido no laboratório de Laemmli, é clivagem endógena da cromatina (ChEC) ¹⁷ . No ChEC, uma fusão entre uma proteína associada à cromatina e MNase é expressa nas células, e após a adição de cálcio para ativar a MNase, o DNA é cortado proximal aos locais de ligação para os marcadosFator ( Figura 1 ). Em conjunto com Southern Blot, o ChEC tem sido usado para caracterizar a estrutura da cromatina e a ligação de proteínas em vários loci individuais em leveduras ^{17 , 18} e foi combinado com análise de microarrays de baixa resolução para investigar a interação de componentes de poros nucleares com o fermento Genoma ¹⁹ . O ChEC oferece benefícios semelhantes a DamID e Calling Card-seq, e sua resolução é quase um par de bases únicas quando analisado pela extensão primária ¹⁹ . O ChEC também é controlável: a clivagem de DNA robusta por MNase depende da adição de cálcio milimolar, garantindo que o MNase seja inativo nas baixas concentrações de cálcio livres observadas em células de fermento vivas ²⁰ .

Anteriormente, postulamos que a combinação de ChEC com sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq) proporcionaria mapas de alta resolução de sites de ligação TF. Na verdade, ChEC-seq gerou mapas de alta resolução dos fatores reguladores gerais de fermento em broto (GRFs) Abf1, Rap1 e Reb1 em todo o genoma ¹ . Também aplicamos o ChEC-seq com sucesso ao complexo Mediador modular, um coativador transcriptional global conservado e conservado ²¹ , expandindo a aplicabilidade dos complexos ChEC-seq para megadalton-size que não contatam diretamente o DNA e podem ser difíceis de serem mapeados pelo ChIP- Métodos baseados. O ChEC-seq é um método poderoso tanto para validação independente de resultados de ChIP-seq quanto para geração de novas idéias sobre a regulação de processos de residência de cromatina. Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a implementação deste método em fermento em brotamento.