Mikrokristallographie von Proteinkristallen und<em> In Cellulo</em> Beugung

Die Verwendung der Röntgenkristallographie zur Bestimmung hochauflösender Strukturen biologischer Makromoleküle hat in den letzten zwei Jahrzehnten einen stetigen Fortschritt erfahren. Die zunehmende Aufnahme der Röntgenkristallographie durch nicht-erfahrene Forscher veranschaulicht die Demokratisierung dieses Ansatzes in vielen Bereichen der Biowissenschaften ¹ .

Historisch gesehen wurden Kristalle mit Abmessungen unter ~ 10 μm als anspruchsvoll, wenn nicht unbrauchbar, für die Strukturbestimmung betrachtet. Die zunehmende Verfügbarkeit von dedizierten Mikrofokus-Strahllinien bei Synchrotronstrahlungsquellen weltweit und technologischen Fortschritten, wie die Entwicklung von Werkzeugen zur Manipulation von Mikrokristallen, hat viel von diesen Barrieren entfernt, die den breiten Einsatz der Röntgenmikrokristallographie vereiteln. Fortschritte in der seriellen Röntgenmikrokristallographie ^{2 , 3} und Mikroelektronenbeugung ⁴ haDass die Verwendung von Mikro- und Nanokristallen zur Strukturbestimmung nicht nur möglich ist, sondern auch manchmal der Verwendung von großen Kristallen ^{5 , 6 , 7} bevorzugt ist.

Diese Fortschritte wurden zuerst auf die Untersuchung von Peptiden ⁸ und natürlichen Kristallen angewendet, die von Insektenviren ^{9 , 10 produziert wurden} . Sie werden nun für ein breites Spektrum biologischer Makromoleküle eingesetzt, darunter die schwierigsten Systeme wie Membranproteine ​​und Großkomplexe ¹¹ . Um die Analyse dieser Mikrokristalle zu erleichtern, wurden sie in Meso , insbesondere Membranproteinen ¹² und in Mikrofluidik-Chips ^13, analysiert.

Die Verfügbarkeit dieser neuartigen Mikrokristallographie-Methoden hat die Möglichkeit der Verwendung videodanVivo-Kristallisation als neuer Weg für die Strukturbiologie ^{14 , 15 , 16,} die eine Alternative zur klassischen in vitro- Kristallogenese bietet. Unglücklicherweise, auch wenn in vivo Kristalle produziert werden können, bleiben mehrere Hindernisse wie der Abbau oder Verlust von Liganden während der Reinigung aus Zellen, Schwierigkeiten bei der Manipulation und Visualisierung der Kristalle an der Synchrotron-Strahllinie und langwierigen Röntgenbeugungsexperimenten. Als Alternative wurden auch Kristalle direkt innerhalb der Zelle ohne Reinigungsschritt ^{17 , 18 , 19} analysiert. Eine vergleichende Analyse deutet darauf hin, dass solche in Cellulo- Ansätze effizienter sein können als die Analyse von gereinigten Kristallen und Ertragsdaten höherer Auflösung ²⁰ .

Dieses Protokoll ist inNeigten dazu, Forschern neu zu helfen, die Protein-Mikrokristallographie neu zu machen. Es bietet Methoden zur Fokussierung auf Probenvorbereitung und Manipulation für Röntgenbeugungsexperimente an einer Synchrotron-Strahllinie. Es werden zwei Möglichkeiten vorgeschlagen, isolierte Kristalle für klassische Mikrokristallographie oder kristallhaltige Zellen zu verwenden, die nach Durchflusszytometrie für die Celluloanalyse sortiert sind ( Abbildung 1 ).