Özet

تحليل التفاعلات البروتين البروتين والمشاركة في توطين بين مكونات الفجوة، ضيق، والمالطيون تقاطعات في الغدد الثديية الفئران

Published: May 30, 2017
doi:

Özet

تقاطعات بين الخلايا هي متطلبات الغدة الثديية وظائف مرحلة محددة والتنمية. توفر هذه المخطوطة بروتوكول مفصل لدراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي) والمشاركة في التعريب باستخدام الغدد الثديية الفئران. هذه التقنيات تسمح للتحقيق في ديناميات الارتباط الجسدي بين التقاطعات بين الخلايا في مراحل تنموية مختلفة.

Abstract

التفاعلات خلية خلية تلعب دورا محوريا في الحفاظ على سلامة الأنسجة والحاجز بين المقصورات المختلفة للغدة الثديية. يتم توفير هذه التفاعلات من قبل البروتينات الوصلي التي تشكل الروابط بين الخلايا المجاورة. ويمكن أن يؤدي سوء توصيف البروتين الوصلي وتقليل الروابط الجسدية مع الشركاء الملتزمين إلى فقدان الوظيفة، وبالتالي إلى اختلال وظيفي في الجهاز. وبالتالي، تحديد توطين البروتين والتفاعلات البروتين البروتين (بي) في الأنسجة الطبيعية والمرض ذات الصلة أمر ضروري لإيجاد أدلة جديدة وآليات تؤدي إلى تطور الأمراض أو تغييرات في الوضع التنموي. تقدم هذه المخطوطة طريقة من خطوتين لتقييم مؤشر أسعار المنتجين في الغدد الثديية الفئران. في القسم بروتوكول 1، يتم وصف طريقة لأداء المناعي المشترك (شارك إف) باستخدام الأجسام المضادة التي تثار ضد البروتينات ذات الفائدة، تليها الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع فلوروكروميس. على الرغم من شارك في إف جميعويعود إلى مظاهرة من قرب من البروتينات، فإنه يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات المادية. لذلك، يتم توفير بروتوكول مفصل لالمناعي المشترك (إب المشترك) في القسم بروتوكول 2. وتستخدم هذه الطريقة لتحديد التفاعلات المادية بين البروتينات، دون التأكد مما إذا كانت هذه التفاعلات مباشرة أو غير مباشرة. في السنوات القليلة الماضية، وقد أثبتت إف شارك وتقنيات الملكية الفكرية المشتركة أن مكونات معينة من تقاطعات بين الخلايا تشارك في توطين والتفاعل معا، وخلق العلاقات التي تعتمد على مرحلة وظيفية التي تختلف أثناء تطوير الغدة الثديية.

Introduction

نمو الغدة الثديية والتنمية يحدث أساسا بعد الولادة. هذا الجهاز يعيد باستمرار نفسه في جميع أنحاء الحياة الإنجابية للثدييات 1 . وتتكون ظهارة الغدة الثديية الكبار من الطبقة الداخلية من الخلايا الظهارية اللمعية وطبقة خارجية من الخلايا القاعدية، وتتكون أساسا من الخلايا الظهارية، وتحيط بها غشاء الطابق السفلي 2 . لمراجعة جيدة على بنية الغدة الثديية والتنمية، يمكن للقارئ الرجوع إلى سترنليشت 1 . خلية الخلايا التفاعلات عبر الفجوة (غ)، ضيق (تي)، و تلتصق (آج) تقاطعات ضرورية للتطور الطبيعي وظيفة الغدة 1 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . المكونات الرئيسية لهذه التقاطعات في الغدة الثديية الفئران هي Cx26، Cx30، Cx32، و Cx43 (غ). كلودين -1، -3، -4، و -7 وزو-1 (تي)؛ و E-كادهيرين، P-كادهيرين، و β-كاتينين (آج) 7 ، 8 . مستويات التعبير عن هذه البروتينات متعددة وظيفية تختلف في طريقة تعتمد على مرحلة أثناء تطور الغدة الثديية، مما يشير إلى متطلبات التفاعل خلية خلية التفاضلية 9 . غ، تي، و آج ترتبط هيكليا ووظيفيا وحبل البروتينات الهيكلية أو التنظيمية الأخرى إلى المواقع المجاورة من الخلايا المجاورة، وبالتالي خلق علاقة الوصلية 10 . تكوين العلاقة الوصلية يمكن أن تؤثر على سد مع الهيكل الخلوي الكامنة، فضلا عن نفاذية العلاقة والاستقرار، ويمكن بالتالي تؤثر على وظيفة الغدة 8 ، 9 ، 10 ، 11 . مكونات تقاطعات بين الخلايا المقيمين في الوصلات الوصلي أو التفاعل مع بعضها البعض في ديفوقد تم تحليل مراحل النمو المتخلفة من تنمية الغدد الثديية مؤخرا باستخدام المناعي المشترك (شارك في إف) وشارك في مناعي (المشارك إب) 9 . في حين تسمح تقنيات أخرى لتقييم الارتباط الوظيفي بين البروتينات، لا يتم عرض هذه الأساليب في هذه المخطوطة.

كما البروتينات مجرد التصرف وحده للعمل، ودراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي)، مثل نقل الإشارات والتسلسل الكيميائي الحيوي، أمر ضروري لكثير من الباحثين ويمكن أن توفر معلومات هامة عن وظيفة البروتينات. كو-إف والتحليل المجهري يساعد على تقييم عدد قليل من البروتينات التي تشترك في نفس الفضاء تحت الخلوية. ومع ذلك، فإن عدد الأهداف يقتصر على الأجسام المضادة، والتي يجب أن تثار في الحيوانات المختلفة، ومن خلال الوصول إلى المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر مختلفة الطول الموجي وكاشف الطيفي لتعدد الإرسال. المشارك إب يؤكد أو يكشف التفاعلات المادية عالية تقارب بيتوإين اثنين أو أكثر من البروتينات المقيمين داخل مجمع البروتين. على الرغم من تطوير تقنيات جديدة، مثل مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) 12 وقرب ربط مقايسة (جيش التحرير الشعبى الصينى) 13 ، والتي يمكن أن تكتشف في وقت واحد توطين وتفاعلات البروتينات، إب المشترك يبقى تقنية مناسبة وبأسعار معقولة لدراسة التفاعلات بين البروتينات الذاتية.

طريقة خطوة بخطوة وصفها في هذه المخطوطة سيسهل دراسة توطين البروتين ومؤشرات الأداء القياسية، وتشير إلى المزالق لتجنب عند دراسة مؤشرات الأداء القياسية الذاتية في الغدد الثديية. تبدأ المنهجية مع عرض إجراءات المحافظة المختلفة للأنسجة المطلوبة لكل تقنية. الجزء 1 يعرض كيفية دراسة البروتين المشارك في توطين في ثلاث خطوات: ط) سيكتيونينغ من الغدد الثديية، إي) وضع علامات مزدوجة أو ثلاثية من البروتينات المختلفة باستخدام تقنية شارك في إف، و 3) التصوير منتوطين البروتين. الجزء 2 يبين كيفية ترسب البروتين الذاتية وتحديد البروتينات المتفاعلة في ثلاث خطوات: ط) إعداد المحللة، إي) غير مباشر مناعي البروتين، و 3) تحديد شريك ملزم من قبل سدز-بادج وغش لطخة الغربية. كل خطوة من هذا البروتوكول هو الأمثل للأنسجة الغدة الثديية القوارض ويولد ذات جودة عالية، محددة، وقابلة للتكرار النتائج. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لدراسات مؤشر أسعار المنتجين في الأنسجة الأخرى أو خطوط الخلايا.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان في الجامعة (المعهد الوطني للإحصاء – أرماند-فرابير، لافال، كندا). 1. تحديد البروتين المشارك التعريب <li style=";text…

Representative Results

لتحديد ما إذا كان غ، آج، و مكونات تي يمكن أن تتفاعل معا في الغدة الثديية، تم تنفيذ المقايسات شارك إف أولا. وقد تم البحث عن Cx26، بروتين غ، و β- كاتينين، بروتين آج، مع الأجسام المضادة المحددة وكشف باستخدام فلوروفور مترافق الماوس 647 (الأخضر، بسيودوكولور) ?…

Discussion

خلية الخلايا التفاعلات عن طريق تقاطعات مطلوبة للوظيفة المناسبة وتطوير العديد من الأجهزة، مثل الغدة الثديية. وقد أظهرت الدراسات أن البروتينات الوصفي يمكن أن تنظم وظيفة واستقرار بعضها البعض وتفعيل تنبيغ الإشارة عن طريق الربط بعضها البعض في غشاء الخلية 10

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يتم تمويل إب من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا منحة (نسيرك # 418233-2012)؛ (فروز دي ريشيرتش دو كيبيك-Santé (فروس)، وهي جائزة مهنية لمؤسسة سرطان الثدي في كيبيك، ومنحة ليدر فونز من منحة المؤسسة الكندية للابتكار. حصل إد على منحة دراسية من مؤسسة ونيفرزيتير أرماند-فرابير.

Materials

Mice strain and stage  St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10X (stock) 1)      Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 
2)      Adjust the PH to 7.4 
3)      Add water to reach to the 1 litre final volume. 
TBS 10X (stock) 1)      Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 
2)      Adjust the PH to 7.5 
3)      Add water to reach to the 1 litre final volume. 
Name Company Catalog Number Yorumlar
Part 1-Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada  BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies  Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  Mentioned in Column D β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Name Company Catalog Number Yorumlar
Part 2-Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0  1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 
2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml).
3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. 
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl 
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada Mentioned in coulmn D Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl 
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl 
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody  (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366)  1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Claudin3  (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody  (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061  Clarity Western ECL Blotting Substrate 
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

Referanslar

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

View Video