Özet

Субпиальный адено-ассоциированный вирус 9 (AAV9) Доставка векселей для взрослых мышей

Published: July 13, 2017
doi:

Özet

Целью настоящего исследования было разработать и обосновать потенцию и безопасность доставки гена, опосредованного спинным адено-ассоциированным вирусом 9 (AAV9), с использованием новой технологии доставки субпиальных генов у взрослых мышей.

Abstract

Ранее сообщалось об успешной разработке метода доставки векторов аденоассоциированного вируса 9 (AAV9) у взрослых крыс и свиней. Было продемонстрировано использование субпиализированных полиэтиленовых катетеров (PE-10 или PE-5) для доставки AAV9, продемонстрирована мощная экспрессия трансгена через спинномозговую паренхиму (белое и серое вещество) в субпиально-инъецированных спинномозговых сегментах. Из-за широкого спектра трансгенных мышечных моделей нейродегенеративных заболеваний существует сильное желание разработать мощную систему доставки центральной нервной системы (ЦНС) для взрослых мышей. Соответственно, настоящее исследование описывает развитие устройства для доставки вектора позвоночной линии и метода для обеспечения безопасной и эффективной доставки спинального AAV9 у взрослых мышей C57BL / 6J. У пациентов с иммобилизованными и обезболиваемыми мышами пиама (шейный 1 и поясничный 1-2 спинальный сегментный уровень) была разрезана с помощью острого иглы 34 G с использованием манипулятора XYZ. Второй XYZ maNipulator затем использовали для продвижения тупой иглы 36G в поясничное и / или цервикальное субпиальное пространство. Затем подкожно вводили вектор AAV9 (3-5 мкл, 1,2 х 10 13 геномных копий (gc)), кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP). После инъекций периодически оценивали неврологическую функцию (моторную и сенсорную), а животных фиксировали перфузией через 14 дней после доставки AAV9 с 4% параформальдегидом. Анализ горизонтальных или поперечных участков спинного мозга показал трансгенную экспрессию по всему спинному мозгу, как в сером, так и в белом веществе. Кроме того, интенсивная ретроградно-опосредованная экспрессия GFP наблюдалась в нисходящих моторных аксонах и нейронах в моторной коре, ядре ruber и formatio reticularis. Никаких неврологических дисфункций не было отмечено у любых животных. Эти данные показывают, что метод доставки субпиальной вектора может успешно использоваться у взрослых мышей, не вызывая травмы спинного мозга, связанные с процедурой, и связан с высокоэффективными трансгенными экспрессиямиВо всей спинальной нейраксии.

Introduction

Использование векторов AAV для лечения различных нейродегенеративных заболеваний спинного мозга и ЦНСН становится хорошо принятой платформой для эффективного усиления или молчания экспрессии интересующего гена (генов). Одним из ключевых ограничений для более эффективного использования этой технологии для лечения расстройств ЦНС / спинного мозга является ограниченная способность доставлять вектор (ы) AAV в паренхиму глубокого мозга или спинного мозга у взрослых млекопитающих.

Было продемонстрировано, например, что системная доставка AAV9 у взрослых грызунов, кошек или не-человеческих приматов лишь умеренно эффективна при индуцировании экспрессии трансгена в нейронах головного и спинного мозга 1 , 2 , 3 . Было показано, что более эффективная интратекальная доставка векторов AAV9 приводит к только ограниченной экспрессии трансгена в анатомически определенных пулах нейронов. В частности, это были демоныЧто цистернальная или пояснично-крестцовая интратекальная доставка AAV9 у нечеловеческих приматов, свиней или грызунов приводит к высокому уровню экспрессии трансгена в спинальных α-мотонейронах и сегментных нейронах ганглиозного сегментарного дорсального корня. Однако минимальное или отсутствующее выражение в спинальных интернейронах или восходящих или нисходящих аксонах в белом веществе показано 4 , 5 , 6 , 7 . В совокупности эти данные показывают, что существует высокоэффективный биологически-анатомический барьер, который предотвращает диффузию интратекально поставленного ААВ в более глубокую спинальную паренхиму.

В предыдущем исследовании, проведенном с использованием взрослых крыс и свиней, была разработана новая методика доставки субпиальных векторов 8 . Используя этот подход, сильная и многосегментная экспрессия трансгена была продемонстрирована после однобалочной субпиальной доставки AAV9. Интенсивное выражение GFP постоянно наблюдалосьВ нейронах, глиальных клетках и нисходящих / восходящих аксонах через вводимые спинномозговые сегменты. Это исследование впервые продемонстрировало, что pia mater представляет собой первичный барьер, ограничивающий эффективную диффузию AAV9 в спинальную паренхиму из интратекального пространства. Хотя этот ранее разработанный метод и субпиальное инъекционное устройство относительно просты в использовании у крупных грызунов (например, крыс) или взрослых свиней, система не подходит для использования у мелких животных, таких как взрослые мыши. Из-за большого числа доступных моделей трансгенных мышей различных нейродегенеративных нарушений существует явная потребность в разработке эффективной техники доставки вектора-паренхиматозного вектора у мышей. Доступность такого метода позволила бы изучить влияние специфического подавления генов ( например, с использованием shRNA) или усиление с использованием неспецифических клеток ( например, цитомегаловирус-ЦМВ или Ubiquitin) или клеточно-специфических ( например, синапсина или глиальных Фибриллярная кислаяБелка (GFAP)) в раннем послеродовом развитии или в больных условиях.

Соответственно, в настоящем исследовании мы разработали и подтвердили систему миниатюрной субпиальной векторной доставки, которая может эффективно использоваться у взрослых мышей. Аналогично, как и в предыдущих исследованиях крыс и свиней, эта работа демонстрирует мощную трансгенную экспрессию во всей спинномозговой паренхиме после однобалочной субпиальной доставки AAV9 у мышей. Простота этого подхода, очень хорошая переносимость вводимых мышей к субпиальной доставке AAV9 и высокая эффективность экспрессии трансгена в спинномозговой паренхиме позволяют предположить, что этот метод можно эффективно реализовать в любой лабораторной обстановке и использовать в экспериментах, нацеленных на экспрессию спинного гена.

Protocol

Эти исследования проводились в соответствии с протоколом, одобренным Институтом по уходу за животными и его использованием в Калифорнийском университете в Сан-Диего, и отвечали рекомендациям Ассоциации по оценке лабораторных рекомендаций по уходу за животными для животных. Все иссл?…

Representative Results

Сильное трансгенное выражение в субпиально AAV9-инъекциях Сегменты: Анализ экспрессии трансгена (GFP) в отделах спинного мозга через 14 дней после доставки AAV9 показал экспрессию GFP, зависимую от AAV9, по всей спинномозговой паренхиме. Во-первых, две двусторон…

Discussion

В настоящем исследовании описывается методика доставки субпиальных векторов (AAV9) у взрослых мышей. Как показано в сопроводительном видео, этот подход и техника могут быть эффективно использованы при условии, что необходимые инструменты и пиа-проникающая игла и субпиальная инъекционн…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантом SANPORC и ALSA Foundation (Martin Marsala); Национальная программа устойчивого развития, номер проекта LO1609 (Чешское министерство образования, молодежи и спорта); И РВО: 67985904 (Стефан Юхас и Яна Юхасова).

Materials

C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50μl Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1000U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

Referanslar

  1. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
  4. Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
  5. Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
  6. Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
  7. Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
  8. Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
  9. Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
  10. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).

View Video