Целью настоящего исследования было разработать и обосновать потенцию и безопасность доставки гена, опосредованного спинным адено-ассоциированным вирусом 9 (AAV9), с использованием новой технологии доставки субпиальных генов у взрослых мышей.
Ранее сообщалось об успешной разработке метода доставки векторов аденоассоциированного вируса 9 (AAV9) у взрослых крыс и свиней. Было продемонстрировано использование субпиализированных полиэтиленовых катетеров (PE-10 или PE-5) для доставки AAV9, продемонстрирована мощная экспрессия трансгена через спинномозговую паренхиму (белое и серое вещество) в субпиально-инъецированных спинномозговых сегментах. Из-за широкого спектра трансгенных мышечных моделей нейродегенеративных заболеваний существует сильное желание разработать мощную систему доставки центральной нервной системы (ЦНС) для взрослых мышей. Соответственно, настоящее исследование описывает развитие устройства для доставки вектора позвоночной линии и метода для обеспечения безопасной и эффективной доставки спинального AAV9 у взрослых мышей C57BL / 6J. У пациентов с иммобилизованными и обезболиваемыми мышами пиама (шейный 1 и поясничный 1-2 спинальный сегментный уровень) была разрезана с помощью острого иглы 34 G с использованием манипулятора XYZ. Второй XYZ maNipulator затем использовали для продвижения тупой иглы 36G в поясничное и / или цервикальное субпиальное пространство. Затем подкожно вводили вектор AAV9 (3-5 мкл, 1,2 х 10 13 геномных копий (gc)), кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP). После инъекций периодически оценивали неврологическую функцию (моторную и сенсорную), а животных фиксировали перфузией через 14 дней после доставки AAV9 с 4% параформальдегидом. Анализ горизонтальных или поперечных участков спинного мозга показал трансгенную экспрессию по всему спинному мозгу, как в сером, так и в белом веществе. Кроме того, интенсивная ретроградно-опосредованная экспрессия GFP наблюдалась в нисходящих моторных аксонах и нейронах в моторной коре, ядре ruber и formatio reticularis. Никаких неврологических дисфункций не было отмечено у любых животных. Эти данные показывают, что метод доставки субпиальной вектора может успешно использоваться у взрослых мышей, не вызывая травмы спинного мозга, связанные с процедурой, и связан с высокоэффективными трансгенными экспрессиямиВо всей спинальной нейраксии.
Использование векторов AAV для лечения различных нейродегенеративных заболеваний спинного мозга и ЦНСН становится хорошо принятой платформой для эффективного усиления или молчания экспрессии интересующего гена (генов). Одним из ключевых ограничений для более эффективного использования этой технологии для лечения расстройств ЦНС / спинного мозга является ограниченная способность доставлять вектор (ы) AAV в паренхиму глубокого мозга или спинного мозга у взрослых млекопитающих.
Было продемонстрировано, например, что системная доставка AAV9 у взрослых грызунов, кошек или не-человеческих приматов лишь умеренно эффективна при индуцировании экспрессии трансгена в нейронах головного и спинного мозга 1 , 2 , 3 . Было показано, что более эффективная интратекальная доставка векторов AAV9 приводит к только ограниченной экспрессии трансгена в анатомически определенных пулах нейронов. В частности, это были демоныЧто цистернальная или пояснично-крестцовая интратекальная доставка AAV9 у нечеловеческих приматов, свиней или грызунов приводит к высокому уровню экспрессии трансгена в спинальных α-мотонейронах и сегментных нейронах ганглиозного сегментарного дорсального корня. Однако минимальное или отсутствующее выражение в спинальных интернейронах или восходящих или нисходящих аксонах в белом веществе показано 4 , 5 , 6 , 7 . В совокупности эти данные показывают, что существует высокоэффективный биологически-анатомический барьер, который предотвращает диффузию интратекально поставленного ААВ в более глубокую спинальную паренхиму.
В предыдущем исследовании, проведенном с использованием взрослых крыс и свиней, была разработана новая методика доставки субпиальных векторов 8 . Используя этот подход, сильная и многосегментная экспрессия трансгена была продемонстрирована после однобалочной субпиальной доставки AAV9. Интенсивное выражение GFP постоянно наблюдалосьВ нейронах, глиальных клетках и нисходящих / восходящих аксонах через вводимые спинномозговые сегменты. Это исследование впервые продемонстрировало, что pia mater представляет собой первичный барьер, ограничивающий эффективную диффузию AAV9 в спинальную паренхиму из интратекального пространства. Хотя этот ранее разработанный метод и субпиальное инъекционное устройство относительно просты в использовании у крупных грызунов (например, крыс) или взрослых свиней, система не подходит для использования у мелких животных, таких как взрослые мыши. Из-за большого числа доступных моделей трансгенных мышей различных нейродегенеративных нарушений существует явная потребность в разработке эффективной техники доставки вектора-паренхиматозного вектора у мышей. Доступность такого метода позволила бы изучить влияние специфического подавления генов ( например, с использованием shRNA) или усиление с использованием неспецифических клеток ( например, цитомегаловирус-ЦМВ или Ubiquitin) или клеточно-специфических ( например, синапсина или глиальных Фибриллярная кислаяБелка (GFAP)) в раннем послеродовом развитии или в больных условиях.
Соответственно, в настоящем исследовании мы разработали и подтвердили систему миниатюрной субпиальной векторной доставки, которая может эффективно использоваться у взрослых мышей. Аналогично, как и в предыдущих исследованиях крыс и свиней, эта работа демонстрирует мощную трансгенную экспрессию во всей спинномозговой паренхиме после однобалочной субпиальной доставки AAV9 у мышей. Простота этого подхода, очень хорошая переносимость вводимых мышей к субпиальной доставке AAV9 и высокая эффективность экспрессии трансгена в спинномозговой паренхиме позволяют предположить, что этот метод можно эффективно реализовать в любой лабораторной обстановке и использовать в экспериментах, нацеленных на экспрессию спинного гена.
В настоящем исследовании описывается методика доставки субпиальных векторов (AAV9) у взрослых мышей. Как показано в сопроводительном видео, этот подход и техника могут быть эффективно использованы при условии, что необходимые инструменты и пиа-проникающая игла и субпиальная инъекционн…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантом SANPORC и ALSA Foundation (Martin Marsala); Национальная программа устойчивого развития, номер проекта LO1609 (Чешское министерство образования, молодежи и спорта); И РВО: 67985904 (Стефан Юхас и Яна Юхасова).
C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |