Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em> Drosophila</em> Göz Disk

1. Ön deneysel Kur 5 gün boyunca 25 ° C'de bir sinek mδ0.5-Gal4 altında nükleer yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eden yumurta ve kültürünü toplayın. Mikrodalga agaroz 1x Fosfat tamponlu tuzlu su, 10 mL agaroz tamamen eriyene kadar (PBS) içinde, düşük erime 0.7 g. 37 ° C kuluçka makinesi içinde kullanıma kadar% 0.7 düşük erime sıcaklıklı jel tutun. Birden fazla 12 saat boyunca% 70 etanol ile forseps, makas 42 mm x 0.17 mm lamelleri, 9 oyuklu cam nokta plaka ve bir manyetik kültür odası dahil olmak üzere tüm ekipman, sterilize edin. % 2 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 0.5 penisilin-streptomisin ve 1.25 mg / ml insülin ile takviye Schneider Drosophila ortamı: kültür ortamı 3 hazırlayın. kirlenmesini önlemek için, bir hücre kültürü kaputu ortamı hazırlar. 4 ° C 'de hazırlanan kültür ortamı Mağaza ve bir ay içinde kullanılır. Diseksiyon platform ve deneyci' temizleyindiseksiyon başlamadan önce ler% 70 etanol ile el. 2. Disk Diseksiyon Hava% 70 etanol gelen tüm ekipman kurutun. Bir sinek şişesinden bir üçüncü evre larva seçin. sinek Flakondan kirlenmesini önlemek için, atık kaldırmak için 1x PBS 3x larva yıkayın. bir diseksiyon mikroskobu altında 9 gözlü cam nokta plakada (oda sıcaklığında) kültür ortamının 1 mL temizlenmiş larva teşrih. Yaklaşık bir arka ucundan bir şekilde üçüncü ve ağız kanca başka forseps ile bir çift forseps ile larva tutun. Iç doku serbest bırakmak için zıt yönlerde iki forseps çekin. Ağız kanca takılı göz-beyin kompleksinden tükürük bezleri, vücut yağ ve manikür çıkarın. ventral sinir kordonu hala bağlı ise, makasla onu kesip. co doku parçası kaldırmak için ağız kanca ve forseps bir çift kavrama forseps bir çift kullanındorsal bölümünde beyinleri ve göz diskleri nnects. NOT: Bu doku kaldırılmazsa, iki göz anten diskler birbirleriyle ve beyne yakın olacaktır. Bu doku, beyin ve göz anten disk, üçgen şekli çünkü göz Diskler daha sonra lamel üzerinde düz olarak durmaktadır olmaz. Ventral-yukarı konuma bütün kompleks döndürün. Beyne kanca veya diski bağlayan filamanın çıkartın. NOT: filaman kaldırılmazsa ağız kanca kaldırıldığında, göz anten disk iki parça bölünecek. Ağız kanca çıkarın. sürecinde göz diski zarar vermemeye özen gösterin. NOT: Göz disk şimdi ortamdaki serbest ve tek optik sap ile beyne bağlı olduğunu. 3. Montaj Hava ve kuru bir 42 mm x 0.17 mm örtücü kısım haznenin bileşenleri bir araya getirin. th tutmak için kapak kayma merkezine O-halkalarının bir çift katmanlı takınE agaroz. lamel ile bölme bir araya getirin. aşama alıcı 42 mm x 0.17 mm lamel koyun. kapak üzerinde bulunan silikon bir O-halkası yerleştirin. tabanını yerleştirin. Sızdırmazlık dolap Kilit kapağı (Şekil 1) koyun. Dikkatli bir şekilde 10-200 uL ucu olan bir 20 uL mikropipet kullanılarak O-ring merkezine parçalara göz-beyin kompleksi aktarın. Sıvı ortamı en iyi çıkarın ve örnek (37 ° C'de),% 0.7 düşük erime noktalı agaroz 12 uL ekleyin. NOT: Göz diskin pozisyon agaroz sertleşmesinden önce forseps ile değiştirilebilir. Agaroz 5 dakika içinde katılaşacaktır. O-ring merkezine oda sıcaklığında 1 ml kültür ortamı ilave et; her biri O-halka 4 örneğe kadar yükleyebilir. Agaroz numunenin sürüklenmesini önlemek için O-ring yapıştırılmış olduğundan emin olun. NOT: ortamın hiçbir havalandırma veya dolaşım gereklidir. 4. Konfokal mikroskopi sıcaklığı eşitlemek için 30 dakika boyunca bir ters konfokal mikroskop aşamasında odasına yerleştirin. Bu görüntüleme sırasında Z ekseni sürüklenme önleyebilir. Uzun süreli canlı görüntüleme önce, doku diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile bozulmamış olup olmadığını kontrol edin. fototoksisite önlemek için, 2 mW altındaki bir lazer gücü kullanacak. görüntüleme için 40X objektif kullanın. 1 um bir optik aralıklarla 12 dakika içinde 62 um, Z-yığın görüntüler elde. 10 saatlik bir toplam üzerinden taramasından 40 döngü elde edin. her döngü görüntüleme 12 dk ve dinlenme 3 dakika içerdiğinden emin olun.