Longo prazo Imagens ao vivo de<em> Drosophila</em> Disco para os olhos

Configuração 1. Pré-experimental Recolhe um ovo de mosca que expressa nuclear proteína fluorescente verde (GFP) sob mδ0.5-Gal4 e cultura a 25 ° C durante 5 dias. Microondas 0,7 g de agarose de baixo ponto de fusão em 10 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) até a agarose estar completamente dissolvida. Manter o gel de baixo ponto de fusão a 0,7% numa incubadora a 37 ° C até à sua utilização. Esterilizar todo o equipamento, incluindo as pinças, tesouras, 42 mm x 0,17 mm lamelas, uma placa de ponto vidro 9 poços, e uma câmara de cultura magnética, com 70% de etanol por mais de 12 h. Prepara-se o meio de cultura 3: meio de Drosophila de Schneider suplementado com 2% de Soro Fetal Bovino (FBS), 0,5% de penicilina-estreptomicina, e 1,25 mg / mL de insulina. Para evitar a contaminação, preparar a forma de um capuz de cultura de células. Armazenar o meio de cultura preparado, a 4 ° C e utilizadas dentro de um mês. Limpe a plataforma de dissecção e o experimentador's mãos com etanol a 70% antes de iniciar a dissecção. Dissecção 2. Disco Air secar todo o equipamento a partir de 70% de etanol. Selecione uma larva de terceiro instar de um frasco mosca. Para evitar a contaminação a partir do frasco de mosca, lavar a larva em 1x PBS, 3x para remover os resíduos. Dissecar a larva limpas em 1 ml de meio de cultura (em RT) na 9-poço da placa de ponto de vidro sob um microscópio de dissecção. Agarrar a larva com um par de pinças em cerca de um terço do caminho a partir da extremidade posterior e mais uma pinça no gancho boca. Puxar as duas pinças em sentidos opostos para libertar os tecidos internos. Retirar as glândulas salivares, gordura corporal, e a cutícula do complexo olho-cérebro ligado ao gancho boca. Se o cordão nervoso ventral está ainda ligado, cortá-lo afastado com uma tesoura. Utilizar um par de fórceps para agarrar o gancho boca e um par de fórceps para remover uma peça de tecido que connects os cérebros e discos de olho na parte dorsal. NOTA: Se esse tecido não é removido, os dois discos olho-antenal será próximos uns dos outros e do cérebro. Os discos oculares, em seguida, não vai ficar na posição horizontal sobre a lamela porque este tecido, o cérebro, e o disco de olho-de antenas irá formar um triângulo. Gire todo o complexo para uma posição ventral-para cima. Remover o filamento que liga o gancho ou disco para o cérebro. NOTA: Se o filamento não é removido, o disco olho-antenal será dividida em duas peças, quando o gancho for removido da boca. Retirar o gancho boca. Tome cuidado para não danificar o disco olho durante o processo. NOTA: O disco olho é agora livre no meio e apenas ligado ao cérebro pela haste óptico. 3. montagem Ar seco e montar os componentes da câmara com um x 0,17 milímetros lamela de 42 mm. Anexar uma dupla camada de O-rings para o centro da lâmina de cobertura para segurar thE agarose. Monte a câmara com lamínula. Coloque a lamela de 42 mm x 0,17 mm no receptor de palco. Coloque o O-ring de silício sobre a tampa deslizante. Coloque a base. Bloqueie o cacifo de vedação e coloque a tampa ( Figura 1 ). Transferir cuidadosamente o complexo olho-cérebro dissecado para o centro do O-ring usando uma micropipeta de 20 μL com uma ponta de 10-200 μL. Remover a maior parte do meio e adicionar 12 μL de 0,7% de agarose de baixo ponto de fusão (a 37 ° C) à amostra. NOTA: A posição do disco ocular pode ser alterada com fórceps antes da solidificação da agarose. A agarose irá solidificar dentro de 5 min. Adicionar 1 mL de meio de cultura à temperatura ambiente ao centro do O-ring; Cada O-ring pode carregar até 4 amostras. Certifique-se de que a agarose é colada ao O-ring para evitar a derivação da amostra. NOTA: Não é necessária ventilação ou circulação do meio. 4. microscopia confocal Coloque a câmara na platina de um microscópio invertido confocal durante 30 minutos para equilibrar a temperatura. Isto pode impedir a dispersão do eixo Z durante a imagiologia. Antes de imagens ao vivo de longo prazo, verificar se o tecido está intacta por microscopia de contraste de interferência diferencial. Para evitar a fototoxicidade, utilize uma fonte de laser abaixo de 2 mW. Use uma objetiva de 40X para a imagem latente. 62? M adquirir imagens Z-stack em 12 min a um intervalo óptico de 1? M. Adquirir 40 ciclos de varrimentos ao longo de um total de 10 h. Assegure-se que cada ciclo contém 12 min de imagiologia e 3 minutos de descanso.