장기의 라이브 영상<em> 초파리</em> 아이 디스크
Özet
이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.
Abstract
라이브 영상은 지속적으로 실시간으로 동적 인 세포 및 발달 과정을 추적 할 수있는 기능을 제공합니다. 초파리 애벌레 성충 디스크는 같은 세포 증식, 분화, 성장, 이동, 세포 사멸, 경쟁, 세포 – 세포 신호 및 구획되지 경계 형성에 많은 생물학적 과정을 연구하는 데 사용되었다. 그러나, 장기적으로 체외 문화와 성충 디스크의 라이브 이미징을위한 방법은 많은 노력에도 불구하고, 만족되지 않았습니다. 최근에, 우리는 장기 체외 문화와 최대 18 시간 동안 성충 디스크의 라이브 영상을위한 방법을 개발했다. 배지에서 높은 인슐린 농도를 사용하는 것 외에도, 저 융점 아가로 오스는 촬상 기간 표류 것을 방지하기 위해 디스크를 삽입 하였다. 이 보고서는 예제로 눈 더듬이 디스크를 사용합니다. 감광체 R3 / 4 특정 mδ0.5-GA4 발현 differen 그 감광체를 입증 하였다tiation 및 ommatidial 회전은 10 시간 라이브 영상 기간 동안 관찰 할 수있다. 이것은 간단한 방법을 기술하는 상세한 프로토콜이다.
Introduction
초파리 애벌레 성충 디스크는 생물학적 메커니즘의 다양한 연구에 대한 선호 실험 시스템이었다. 이러한 디스크는 두 상피 층에 의해 구축 SAC 형상 구조 배아 상피에서와 invaginate되고, Peripodial 상피 (PE)과 적절한 디스크 (DP) (1, 2). 성충 디스크 세포가 증식하고 점진적으로 애벌레와 번데기 단계에서 차별화하고 결국 성인 신체 구조로 개발한다. 성충 인해 디스크의 평탄 단순한 2 층 구조로, 그들은 유충 해부시 관찰하기 쉽다. 그러나, 많은 단체의 여러 노력에도 불구하고, 성충 디스크의 장기적인 문화에 대한 현재의 방법은 만족되지 않았습니다. 우리는 최근에 최대 18 시간 동안 여러 성충 디스크의 정상적인 발전을 지속 할 수있는 배양 방법을 개발하고 라이브 영상 3 수 </s>까지. 배양 방법은 세포 분화 및 이동을 지원할 수 있지만, 단지 7-12 시간 동안 세포 증식을 지원할 수 있고, 디스크의 성장을 지원할 수 없다. 배지의 주요 차이점은 인슐린 (3)의 높은 농도이다. 방법은 간단하고, 특별한 포기 또는 매체 순환이 필요하지 않습니다.
가장 잘 연구 된 성충 디스크 중 하나는 눈 더듬이 디스크입니다. 초파리의 눈은 약 800 ommatidia, 개안을 구축한다. 각 개안 8 개의 시각 세포 (R1-R8)로 구성된다. 애벌레 눈 디스크에서, 광 수용체 세포 (4, 5)을 전방에서 후방에 눈 디스크를 가로 질러 밭고랑 형태 발생 (MF)의 통과에 따라 차별화. 개안의 감광체 R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 및 R8 (6) 다음에, 시작하여 순차적으로 구별. 등쪽의 ommatidia, 개안 및했습니다눈 디스크 ntral 반쪽 반대 키랄성 7, 8의 결과로, 반대 방향으로 90 ° 회전을 겪는다. 회전 공정은 두 단계로 발생한다 : 먼저, 45 ° 회전에서 시작하고 MF 뒤에 여섯째 ommatidia, 개안 행에서 완성된다; 제 45 ° 회전을 행 16 9, 10에 대해 완료된다. R3 리 / 4 특정 mδ0.5 GA4-11로 표시 ommatidial 회전 사용이 연구는, 배양이 방법을 통해 관찰 될 수있는 정상 세포 분화 및 역학을 설명하며 눈 디스크 이미지를 살.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 Drosophila imaginal disc에 대한 장기 생체 영상 실험을위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 디스크 손상을 피하고 커버 슬립에 디스크를 부착 할 수 있도록 많은 시간을 보냈습니다. 조직을 유지하기 위해 Poly-L-Lysine (PLL)과 저 융점 아가로 오스를 시도했습니다. 결국, 저 융점 아가로 오스는 조직을 유지하는 능력이 더 좋았다. 이 방법은 10 시간의 생체 영상주기 동안 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전이 정상적으로 발생 함을 보여주기 위해 눈 디스크 만 사용되었지만이 방법은 다른 하나의 디스크 인 날개 디스크에도 적용 할 수 있습니다. 이전 연구 3 . 또한, 배양 배지 준비 및 라이브 이미징 설정은 간단하며 폭기 또는 매질 순환을 필요로하지 않습니다.
지속적인 라이브 이미징은 생물학적 전날의 명확한 시간 순서를 제공 할 수 있습니다국세청. 눈 디스크에 아교 세포의 분화 및 마이그레이션의 우리의 이전 보고서에서, 우리는 포장 아교이 눈 디스크 3의 전방으로 마이그레이션 한 후 기존의 아교 세포에서 분화 것을 직접 증거를 제공했다. 장기 생체 문화는 자신의 행동을 삼을 따르지 같은 카에데 형광 단백질의 광 변환과 같은 세포의 특정 레이저 활성화 라벨 수 있습니다. 또한, 배양 배지에 직접 첨가되는 화학 물질의 테스트를 수용 할 수있다; 따라서,이 약물 스크리닝 플랫폼으로 사용될 수있다. 일부 동적 프로세스 분 또는 초에서 발생하기 때문에, 높은 시간 분해능이 요구된다. 시간적 해상도 광 시트 현미경 (15, 16) 또는 회전 디스크 현미경 (17)을 강화하기 좋은 선택 일 수있다.
현재 문화 상태가 완벽하지 않습니다. 그것은 디스크 성장을 지원하지 않습니다. 셀 Proliferation은 최대 12 시간 3 지원됩니다. 생체 외 배양 12 시간 후, 감광체의 분화의 비율을 3 감소하기 시작한다. 이것은 특정 영양소 나 호르몬의 부족으로 인해 수 있습니다. 이 배지에서 큰 차이가 인슐린의 높은 농도 때문에, 포유 동물 인슐린 내인성 인슐린 유사 펩타이드의 기능을 모방 한 부분 일 수있다. 플라이 추출물, 곤충 혈당 트레할로스 및 탈피 호르몬 20 hydroxyecdysone 다양한 농도의 첨가, 3 유용하지 않았다. 그러나, 12 ~ 18 시간 배양 기간은 많은 발달 과정을 연구하기에 충분하다. 애벌레 성충 디스크를 배양 대체 배양 방법 3을 비교되었고, 우리의 배양 및 이미징 조건은 라이브 영상에 대한 가장 긴 시간 창 및 대부분의 선명도를 제공합니다. 라이브 유충 및 번데기에서 디스크를 직접 영상화 할 수 있지만18, 19, 20, 21, 22, 관측 분해능과 시간 창 제한된다. 늦은 애벌레와 번데기 디스크는 오랜 시간이 23, 24에 대한 배양 있지만 디스크는 중요한 형태 형성을받을 수 있습니다. 평면, 2D 애벌레 디스크를 활용하기 위해, 우리의 배양 및 이미징 방법은 지금까지 최고의 솔루션입니다.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 플라이 주식을 플라이 음식을 준비하고 유지하기위한 천-란 수와 유 치 양에게 감사하며, 스와 핑 리와 공 초점 현미경과의 도움을 IMB 이미징 코어에. 본 연구는 101-2321-B-001 -004, NSC-100-2321 -012 B-001, B-102-2321 NSC-001 -002, MOST 103-2311-B-001 YHS (NSC에 보조금 지원 국립 과학위원회와 중국의 공화국 과학 기술부에서 -035 -MY3).
Materials
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
Referanslar
- Cohen, S. M., Bate, M., Martinez-Arias, A. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. 2, 747-842 (1993).
- Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).
- Wolff, T., Ready, D. F. . The Development of Drosophila Melanogaster. , 1277-1316 (1993).
- Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).
- Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).
- Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).
- Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).
- Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, ., Wittbrodt, F., J, E. H., Stelzer, Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).
- Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
- Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7 (1), (2012).
- Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).
- Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).
- Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D’Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).
- Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).
- Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).
