このプロトコルは、長期のex vivo培養およびショウジョウバエ成虫ディスクのライブイメージングのための詳細な方法を記載しています。それは目のディスクのライブイメージングの10時間の期間内に光受容体の分化と個眼回転を示します。プロトコルは簡単で、高価なセットアップを必要としません。
ライブイメージングは、連続的にリアルタイムでダイナミックな細胞や発達過程を追跡する機能を提供します。 ショウジョウバエの幼虫成虫は、このような細胞の増殖、分化、成長、移動、アポトーシス、競争、細胞-細胞シグナリング、およびコンパートメントの境界形成など多くの生物学的プロセスを研究するために使用されています。しかし、長期のex vivoでの文化や成虫のライブイメージングのための方法には多くの努力にもかかわらず、満足のいくものではなかったです。最近、我々は、長期ex vivoで培養し、最大18時間成虫のライブイメージングのための方法を開発しました。培養培地中で高いインスリン濃度を使用することに加えて、低融点アガロースは、撮像期間中にドリフトを防ぐためにディスクを埋め込むために使用されました。このレポートは、一例として目触角ディスクを使用します。感光R3 / 4特異mδ0.5-GA4の発現は、その感光体differenを実証するために行きましたtiationと個眼回転は10時間ライブイメージング期間中観察することができます。これは、この簡単な方法を説明する詳細なプロトコルです。
ショウジョウバエの幼虫成虫は、生物学的メカニズムの多種多様の研究のために有利な実験システムとなっています。これらのディスクは、2つの上皮層によって構築嚢のような構造を胚上皮から陥入となり、Peripodial上皮(PE)及び適切なディスク(DP)1、2。成虫盤細胞が増殖し、徐々に幼虫と蛹の段階で区別し、最終的には成人の身体構造へと発展します。成虫のフラットでシンプルな2層構造に、彼らは幼虫から解剖したときに観察することが容易です。しかし、多くのグループによって、いくつかの努力にもかかわらず、成虫の長期培養のための現在の方法では満足のいくものではなかったです。我々は最近、最大18時間の複数の成虫の正常な発達を維持することができる培養法を開発し、それがライブイメージング3ことを可能にします</s>アップ。培養方法は、細胞分化および移動をサポートすることができ、それだけで7-12時間、細胞増殖をサポートすることができ、ディスクの成長をサポートすることができません。培養液中の主な違いは、インスリン3の高濃度です。方法は簡単で、特別な通気や媒体循環は必要ありません。
最もよく研究成虫の一つは目を触角です。 ショウジョウバエの目は、約800個眼を築いています。それぞれ個眼は、8個の光受容体細胞(R1-R8)から構成されています。幼虫の眼ディスクにおいて、光受容体細胞は、前4、5の後方から眼ディスクを横切って掃引形態形成畦間(MF)の通路下記分化します。個眼における光受容体は、R2 / R5、R3 / R4、R1 / R6、及びR7 6続いR8、で始まり、シーケンスに分化します。背側での個眼とVEの眼ディスクのntral半分は、反対のキラリティー7,8で得られた、反対方向に90°の回転を受けます。回転プロセスは、2つの段階で起こる:最初に、45°回転で始まり、MFの背後にある第六の個眼列で完了する。第二の45°の回転は、約行16 9、10で終了します。本研究では、培養とライブ画像目のディスクに、この方法を介して観察することができる正常な細胞分化および動態を実証するために、R3 / 4特異mδ0.5-GA4 11によってマーク、個眼の回転を用います。
本研究では、 ショウジョウバエ成虫の長期的なライブイメージング実験のための詳細なプロトコルを提供します。私たちは、ディスクの損傷を避けるためにしてカバースリップに近いディスクの取り付けを可能にするために慎重な解剖の練習に多くの時間を費やしました。我々は、組織を保持するためにポリ-L-リジン(PLL)及びアガロース低融点を試みました。最後に、低融点アガロースは、組織を保持するためのより良い能力を示しました。唯一目のディスクは10時間ライブイメージング期間中の光受容体の分化と個眼回転の正常な発生を実証するために、本論文で使用したもののに示されているように、この方法はまた、少なくとも一つの他のディスク、翼ディスクに適用することができます以前の研究3。また、培養液の準備とライブイメージングのセットアップは簡単ですし、通気や媒体循環を必要としません。
連続ライブイメージングは、生物学的前夜の明確な時間的順序を提供することができますnts。私たちは、眼の椎間板におけるグリアの分化および移動の以前の報告において、眼球3の前に移動した後、グリアが既存のグリアから分化するという直接的な証拠を提供した。長期間のエクスビボ培養は、KAEDE蛍光タンパク質の光変換などの細胞の特異的なレーザー活性化標識が、その挙動に従うことを可能にする3 。また、培地に直接添加される化学物質の試験にも対応できます。したがって、これは薬物スクリーニングプラットフォームとして使用することができる。いくつかの動的プロセスは数分または数秒以内に発生するため、高い時間分解能が必要です。時間分解能を高めるために、薄いシート顕微鏡15,16またはスピニングディスク顕微鏡17が良い選択肢となり得る。
現在の培養条件は完全ではありません。ディスクの拡張はサポートされていません。セルproliferationは、最大12時間3に対してサポートされています。 エクスビボ培養で12時間後、光受容体の分化の速度が3減少し始めます。これは、特定の栄養素やホルモンの欠如に起因する可能性があります。この培地中の主要な違いは、インスリンの高濃度であるので、哺乳動物のインスリンは、内因性のインスリン様ペプチドの機能を模倣する部分であってもよいです。ハエ抽出物、昆虫血糖トレハロース、及び脱皮ホルモン20-ヒドロキシの種々の濃度の添加は、3有益ではなかったです。しかし、12〜18時間の培養期間は、多くの発生過程を研究するのに十分です。幼虫成虫を培養するための代替培養法は、3を比較した、と私たちの培養およびイメージング条件は、ライブイメージングのための最長時間ウィンドウと最も明快さを提供します。ライブ幼虫と蛹内のディスクは、直接画像化することができますが18、19、20、21、22は 、観察用の解像度と時間窓が限られています。後期幼虫と蛹のディスクは、長い時間の23、24のために培養することができますが、ディスクは重要な形態形成を受けます。フラット、2D幼虫ディスクを利用するには、私たちの培養およびイメージング法は、これまでの最適なソリューションです。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、フライ食品を準備し、共焦点顕微鏡で彼らの助けのために、そして蘇-ピン・リーとIMBイメージングコアにフライストックを維持するためのチョン-ラン・スとゆうチーヤンに感謝しています。この研究は、101から2321-B-001 -004、NSC 100から2321-B-001 -012、NSC 102から2321-B-001 -002、MOST 103から2311-B-001 YHS(NSCへの助成金によって支援されました国家科学委員会と中国の共和国の科学技術省から-035 -MY3)。
Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |