Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

A fosforilação de proteínas num resíduo específico desempenha um papel significativo numa vasta gama de processos celulares. Assim, a compreensão das redes de sinalização requer a identificação de locais específicos de fosforilação. Além disso, o local de fosforilação determina o efeito na função da proteína porque os domínios individuais dentro de uma proteína possuem estruturas e funções diferentes. A atividade do fator nuclear 2 relacionado ao eritróide 2 (Nrf2), um importante fator de transcrição antioxidante, é regulada bidirecionalmente através da fosforilação em diferentes locais. Nossos estudos têm se concentrado nas quinases que catalisam a fosforilação de Nrf2. A resposta ao estresse de Nrf2 contra o desafio oxidativo ocorre rapidamente, principalmente através da fosforilação na serina 40 e mediada pela proteína quinase C (PKC) -δ, que ativa Nrf2 ^{3 , 4} . Por outro lado, Fyn catalisa a fosforilação inibitória de Nrf2 na tirosina 568 para controlo rigoroso da actividade ⁵ .

O método mais comum utilizado para descobrir locais de fosforilação é a cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC / MS). Dados de mapeamento de sítios de fosforilação rápidos e altamente sensíveis podem ser gerados deste modo; No entanto, tem várias limitações técnicas, muitas vezes gerando sinais falsos negativos. Frequentemente ocorre uma fraca cobertura de sequências na análise de LC / MS. Para identificar locais de fosforila�o, �necess�ia informa�o sobre a cobertura m�ima de amino�idos de uma prote�a ⁶ . A proteólise da proteína de interesse com várias proteases durante o passo de digestão pode ser de ajuda na melhoria da cobertura da sequência. Outro obstáculo para a identificação de resíduos de fosforilação é a fácil perda de ácido fosfórico que é frequentemente observada para os péptidos fosforilados com serina e treonina 6,7. As porções fosfato labílicas são frequentementeLibertado dos fosfopéptidos durante o processo de fragmentação ⁷ . A segunda opção quando se procura locais de fosforila�o �utilizar um m�odo de microarrays de p�tidos. É possível pesquisar os locais alvo de cinase utilizando um chip de microarray contendo fragmentos peptídicos derivados de uma proteína de interesse. No entanto, devido ao requisito de equipamento para a produção e detecção de um chip de microarray, o método de microarray de péptido é considerado demorado e dispendioso.

Para ultrapassar estes desafios, pode ser utilizado um ensaio de quinase concorrente de oligopéptido in vitro para uma proteína quinase com motivos de reconhecimento conhecidos. Se o motivo de reconhecimento de consenso de uma quinase for estabelecido, os sítios de fosforilação putativos de um substrato candidato podem ser previstos e a autenticidade dos sítios pode ser validada. O método mais convincente para este procedimento é mostrar a anulação da fosforilação numa proteína mutante na qual o predicteD é substituído por um aminoácido não fosforilável ( isto é, serina ou treonina em alanina, tirosina em fenilalanina). No entanto, a produção e isolamento de proteínas mutantes é demorada. Como uma alternativa na fase inicial da pesquisa, o ensaio de peptídeo quinase competitivo é simples e conveniente. Aqui, descrevemos um protocolo para um ensaio de competição de péptidos in vitro e para a validação do local de fosforilação.