Registrazioni Patch-clamp intere cellule delle cellule epiteliali primarie isolate dall'epididimo
Özet
Presentiamo un protocollo che combina l'isolamento delle cellule e la registrazione delle patch-clamp a cellule intere per misurare le proprietà elettriche delle cellule epiteliali primarie dissociate dagli epididimidi di cauda di cauda. Questo protocollo consente di indagare le proprietà funzionali delle cellule epitidimali epididimali primarie per illustrare ulteriormente il ruolo fisiologico dell'epididimo.
Abstract
L'epididimo è un organo essenziale per la maturazione dello sperma e la salute riproduttiva. L'epitelio epididimo è costituito da tipi cellulari connessi intricati e distinti non solo in termini molecolari e morfologici ma anche in proprietà fisiologiche. Queste differenze riflettono le loro diverse funzioni, che insieme stabiliscono il microambiente necessario per lo sviluppo spermatico post-testicolo nel lume epididimale. La comprensione delle proprietà biofisiche delle cellule epitidimali epiteliali è fondamentale per rivelare le loro funzioni nello sperma e nella salute riproduttiva, in condizioni sia fisiologiche che patofisiologiche. Mentre le loro proprietà funzionali devono ancora essere completamente chiarite, le cellule epitidimali epiteliali possono essere studiate usando la tecnica patch-clamp, uno strumento per misurare gli eventi cellulari e le proprietà delle membrane delle singole cellule. Qui descriviamo i metodi di isolamento delle cellule e la registrazione di patch-clamp a cellule intere a meaAssicurare le proprietà elettriche delle cellule epiteliali primarie dissociate dagli epididimidi cauda del caudali.
Introduction
L'epididimo nel tratto riproduttivo maschile è un organo allineato con uno strato di cellule epiteliali mosaiche. Come in altri tessuti epiteliali, i diversi tipi di cellule dell'epitelio epididimo, comprese le cellule principali, le cellule chiare, le cellule basali e le cellule dei sistemi immunologici e linfatici, funzionano in modo concertato per funzionare come barriera alla linea frontale tubulare e come Sostenere le cellule per la maturazione e la fisiologia dello sperma 1 , 2 , 3 . Così, queste cellule epiteliali svolgono un ruolo essenziale nella salute riproduttiva.
Le cellule epiteliali sono generalmente considerate come cellule non eccitabili che non sono in grado di generare potenziali d'azione di tutti o nessuno in risposta a stimoli depolarizzanti, a causa della mancanza di canali Na + o Ca 2+ a tensione 4 , 5 . Tuttavia, le cellule epiteliali esprimono uniQue set di canali ionici e trasportatori che regolano i loro ruoli fisiologici specializzati, come il secreto e il trasporto dei nutrienti 6 . Diverse cellule epiteliali quindi possiedono caratteristiche elettriche caratteristiche. Ad esempio, le cellule principali esprimono il CFTR per il trasporto di fluidi e cloruri e esprimono il TRPV6 per il riassorbimento del calcio, mentre le cellule chiare esprimono la pompa protonica V-ATPasi per l'acidificazione lumina 1 , 7 , 8 , 9 . Sono stati riportati alcuni trasportatori e canali ionici che regolano le caratteristiche fisiologiche delle cellule epitidimali epiteliali, ma le proprietà funzionali delle cellule epitidimali non sono ancora state ancora comprese 10 , 11 , 12 , 13 .
WhLa registrazione di patch-clamp di olea-cell è una tecnica ben consolidata per esaminare le proprietà intrinseche di cellule eccitabili e non-eccitabili ed è particolarmente utile per studiare le funzioni delle cellule principalmente dissociate in campioni di cellule eterogenee; Il morsetto di tensione viene utilizzato per misurare le proprietà passive della membrana e le correnti ioniche delle singole cellule 14 , 15 . Le proprietà passive della membrana includono la resistenza di ingresso e la capacità. L'ex parametro indica la conduttanza intrinseca della membrana, mentre quest'ultima implica la superficie della membrana cellulare (un bilayer di fosfolipidi, dove sono posizionati canali ionici e trasportatori), che funge da sottile isolante che separa i media extracellulari e intracellulari). La capacità della membrana è direttamente proporzionale alla superficie della membrana cellulare. Insieme alla resistenza della membrana che si riflette dalla resistenza di ingresso, la costante di tempo della membrana, wChe indica quanto velocemente il potenziale della membrana cellulare risponde al flusso delle correnti del canale ionico, può essere determinato. A questo proposito, combinando le caratteristiche di risposta di corrente da una serie di passi di tensione applicati alle cellule, le cinetiche biofisiche e le proprietà delle cellule sono determinate 15 , 16 , 17 , 18 .
Nel presente documento descriviamo le procedure per l'isolamento delle cellule epiteliali dal ratto cauda epididymis e le fasi per misurare le proprietà delle membrane di differenti tipi di cellule nella miscela cellulare dissociata usando il patch-clamp di tutta la cellula. Mostriamo che le cellule principali epididimali presentano proprietà elettrofisiologiche distinte delle membrane e che le conduttanze possono essere facilmente identificate da altri tipi di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, la dispersione enzimatica dei cauda epididimidi di ratto ha fornito costantemente cellule epiteliali sane. La qualità delle cellule epitidimali epiteliali per gli esperimenti di patch-clamp dipende da alcuni passi critici del protocollo. Per esempio, la centrifugazione della miscela cellulare a bassa forza centrifuga (30 xg) è importante per eliminare lo spermatozoo e il contenuto lumino epididimo; Le cellule epitidimali epiteliali diventano insalubre in presenza degli spermatozoi nella coltura c…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il dottor Christopher Antos per i commenti utili sul testo. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di start-up dell'Università di ShanghaiTech assegnati a Winnie Shum e dai finanziamenti della National Science Foundation di Cina (NNSFC n.331471370).
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
Referanslar
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
