Determinación de alta afinidad anticuerpo-antígeno Cinética de unión usando cuatro plataformas Biosensor
Özet
Se describe aquí protocolos para la medición de antígeno-anticuerpo de afinidad y la cinética utilizando cuatro plataformas de biosensores de uso común vinculante.
Abstract
biosensores ópticos etiqueta libre son poderosas herramientas en el descubrimiento de fármacos para la caracterización de interacciones biomoleculares. En este estudio, se describe el uso de cuatro plataformas de biosensores utilizados rutinariamente en nuestro laboratorio para evaluar la afinidad de unión y la cinética de diez anticuerpos de alta afinidad monoclonales (mAbs) contra proproteína convertasa subtilisina humana Kexin tipo 9 (PCSK9). Mientras tanto Biacore T100 y ProteOn XPR36 se derivan de la Resonancia bien establecida Plasmon Superficie tecnología (SPR), el primero tiene cuatro células de flujo conectados por la configuración de flujo en serie, mientras que el último presenta 36 puntos de reacción en paralelo a través de una improvisada 6 x 6 entrecruzado configuración de los canales de microfluidos. El IBIS MX96 también opera basado en la tecnología de sensor SPR, con una función de proyección de imagen adicional que proporciona la detección en la orientación espacial. Esta técnica de detección acoplada con el flujo Microspotter continuo (CFM) se expande el rendimiento significativamente por correonabling impresión array multiplex y la detección de 96 deportes de reacción simultáneamente. En contraste, el Octeto RED384 se basa en el principio óptico biocapa Interferometría (BLI), con sondas de fibra óptica que actúa como el biosensor para detectar patrón de interferencia cambia en las interacciones de unión en la superficie de la punta. A diferencia de las plataformas basadas en SPR, el sistema de BLI no se basa en fluidos de flujo continuo; en cambio, las puntas de los sensores recogen lecturas mientras están sumergidos en soluciones de analito de una microplaca de 384 pocillos durante la agitación orbital.
Cada una de estas plataformas de biosensores tiene sus propias ventajas y desventajas. Para proporcionar una comparación directa de la capacidad de estos instrumentos para proporcionar datos cinéticos de calidad, los protocolos descritos ilustran experimentos que utilizan el mismo formato de ensayo y los mismos reactivos de alta calidad para caracterizar la cinética de anticuerpo-antígeno que se ajustan a la sencilla 1: modelo de interacción molecular 1 .
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro estudio comparación cabeza a cabeza muestra que cada plataforma biosensor tiene sus propias fortalezas y debilidades. A pesar de que los perfiles de unión de los anticuerpos son similares por comparación visual (Figuras 3 – 6), y el orden de rango de las constantes de velocidad cinética adquirida son altamente consistentes a través de los instrumentos (Figura 7), nuestros resultados muestran que los instrumentos SPR-basa con fluidos de flujo continuo) son mejores en la resolución de interacciones de alta afinidad con velocidades de disociación lentas. Deriva hacia arriba durante la fase de disociación se observa en conjuntos de datos (por ejemplo, mAb 2, mAb 5, y mAb 9; Figura 5) generado por el BLI instrumento-fluídica libres. Este hallazgo puede atribuirse en gran parte a la evaporación de la muestra con el tiempo en la microplaca, lo que es una limitación principal del sistema. Con esta limitación inherente, el tiempo experimental también se limita a menos de 12 h; por lo tanto, los experimentos se programan con shveces Örter (Asociación 500 s y 30 min de disociación) en comparación con los de las otras plataformas (asociación 10 min y 45 min de disociación). Sin embargo, la reducción del tiempo experimental no parece mitigar el impacto de la evaporación en la calidad de datos / consistencia, ya que las constantes de velocidad generados por el instrumento basado en el BLI muestran menos linealidad como resultado de las fluctuaciones en algunas de las velocidades de disociación (Figura 8C ). Además de la evaporación de la muestra, las diferencias en los reactivos de captura utilizados pueden también han contribuido a las diferencias en los resultados obtenidos. Mientras que la proteína A / G se usó en las tres plataformas de SPR basados en fluídicos, los sensores AHC se utilizaron en la plataforma BLI no-fluídica. Dado que la proteína A / G es probable que tenga una afinidad más débil para los mAbs que lo hace el AHC, una superficie biosensor basado en anticuerpos, las velocidades de disociación del complejo mAb-antígeno de la / las superficies de proteína A G puede aparecer artificialmente más rápido que aquellos obtenido a partir de la superficie AHC. Esta posibilidad es apoyada by los datos experimentales que muestran que los valores fuera de la tasa generados por la plataforma BLI fueron consistentemente inferiores a los obtenidos a partir de los otros instrumentos (Figura 7, línea roja). Sin embargo, la plataforma BLI tiene diferentes ventajas sobre las otras plataformas. Por ejemplo, es muy flexible con respecto a la elección del sensor y configuración de ensayo debido a los diversos sensores de pre-revestido para su uso inmediato. En nuestros experimentos, el uso de los sensores de AHC eliminó la necesidad de pasos ligando de inmovilización, reduciendo el tiempo de preparación. Además, la plataforma de BLI requiere mucho menos mantenimiento en comparación con las otras plataformas de fluidos SPR, que cuentan con configuraciones de tubos y conmutador de valor complicados. Esta característica es una ventaja para los experimentos que implicaban muestras crudas que pueden causar problemas de obstrucción y de contaminación.
Como la demanda de la identificación eficiente, rápida y precisa de candidatos terapéuticos aumenta, la necesidad de birendimiento osensor también está aumentando. Entre las cuatro plataformas de biosensores, el rendimiento del biosensor capaz de 96-ligando de impresión de matriz es el más alto, seguido por el biosensor acoplada a un entrecruzándose formato de 36-ligando y el biosensor basado en BLI con lectura simultánea de 16 canales, que en última instancia aumentar el número de interacciones medidos en un único ciclo de unión a 96, 36 y 16, respectivamente. Estas capacidades de rendimiento son significativamente más altas que la de la plataforma de SPR tradicional, que está limitado por tener sólo cuatro células de flujo conectados por un único flujo en serie. Desde nuestros experimentos incluyeron un conjunto relativamente pequeño de la muestra de 10 mAb evaluados en varias densidades de superficie con tiempos largos de disociación, los rendimientos instrumentales jugaron un papel moderado en la determinación de la eficiencia de los experimentos. No hubo diferencias significativas en los tiempos experimentales de las tres plataformas de alto rendimiento, y en todos los casos se realizaron los experimentos en un día. Por otra parte, los experimentos tradicionales SPR de flujo en serie requieren 3 días para completar, a pesar de la automatización del walk-away de adquisición de datos después de la instalación. En otros estudios que implican un gran número de muestras (es decir, en los cientos o miles), para los propósitos de clasificación de disociación / detección cinética o de agrupación de epítopos, el rendimiento se convierte en un factor crítico.
Aunque el rendimiento en el IBIS MX96 es órdenes de magnitud más alta que la de los otros biosensores y por lo tanto es una elección óptima para estos propósitos, tiene una serie de deficiencias. En particular, la matriz de impresión por el CFM muestra grandes inconsistencias de superficie (Figura 1) y la reducción de reproducibilidad de datos (Figura 8D y 8E). Para mediciones cinéticas exactas, la cantidad de ligando en la superficie biosensor es un parámetro crítico que debe ser controlado para asegurar que las respuestas de unión no se vean perturbadas por factores secundarios, tales comola transferencia de masa o impedimento estérico. Para el Biacore T100 y ProteOn XPR36, los niveles óptimos R L se determinaron sobre la base del cálculo estándar de los valores max conjunto R como se describe en el artículo de investigación 17. Por otro lado, para las plataformas Octeto RED384 y IBIS MX96, los niveles de mAb de captura se alcanzaron empíricamente usando una serie de anticuerpos de 2 veces diluidas en serie a veces constantes. La falta de conocimiento o el control de la etapa de captura resultó en una superficie de alta densidad y las señales de alta unión de respuesta (Figura 2) que puede haber comprometido la exactitud de las constantes cinéticas de velocidad. Además, la separación de la impresora desde el detector SPR también presenta un desafío cuando se realizan varias mediciones de ciclo de unión que implican regeneraciones. La única manera de realizar la configuración de la cinética de multi-ciclo fue a través de acoplamiento de aminas directa de los mAbs, en contraposición a capturar a través del mAb Fc por la proteína inmovilizada A / Gsuperficie en las otras tres plataformas biosensor. Como resultado, se requiere un experimento regeneración de exploración adicional para determinar las condiciones óptimas de regeneración. El resultado de esta configuración se relacionó con un 90% menor actividad superficial observada ~ en comparación con el método de captura de Fc (Figura 9), además de un tiempo de experimentación más tiempo. Para ejecutar el método de captura de Fc, se adoptó un enfoque cinética de un solo ciclo alternativo. Este enfoque implica la inyección secuencial de analito a concentraciones crecientes sin regeneración entre cada inyección (Figura 2). Este enfoque altamente conveniente, pero menos comúnmente aplicado no sólo acorta el tiempo experimental y redujo el consumo de reactivos, sino que también produjo constantes cinéticas muy similares a las de los otros biosensores (Figura 7). Por lo tanto, la aplicación de este enfoque cinética de ciclo único supera la limitación de configuración inherente del instrumento y presenta unaoportunidad para la obtención de alta resolución constantes de velocidad cinética en una forma de alto rendimiento.
A pesar del rendimiento de ser una limitación importante en el Biacore T100, nuestros resultados muestran colectivamente que generó los datos más consistentes con la más alta calidad. Esto fue seguido por la ProteOn XPR36, que tiene ~ 10 veces mayor rendimiento. Su capacidad para generar datos de alta calidad se convierte en una ventaja cuando la caracterización de las interacciones anticuerpo-antígeno de alta afinidad que pueden ser técnicamente difícil cuando se alcanzan los límites de detección de los instrumentos. Si bien las limitaciones sistemáticas en la instrumentación del octeto RED384 obstaculizan la medición precisa de las constantes de velocidad de disociación (es decir, por debajo de la sensibilidad para resolver suficiente degradación de señal para lenta fuera de tarifas), tanto el Biacore T100 y ProteOn XPR36 puede proporcionar sensible y fiable detección para la diferenciación.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Noah Ditto y Adam Miles de asistencia técnica en el IBIS MX96.
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
Referanslar
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