네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정
Özet
우리는 여기에 설명 친화력 네 일반적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 반응 속도를 결합 항체 – 항원의 측정을위한 프로토콜.
Abstract
라벨이없는 광 바이오 센서는 생체 분자 상호 작용의 특성에 대한 신약 개발에 강력한 도구입니다. 이 연구에서 우리는 결합 친화와 인간의 proprotein convertase의 서브 틸리 켁신 유형 (9)에 대한 열 높은 친화력 단일 클론 항체 (단클론 항체) (PCSK9)의 역학을 평가하기 위해 우리의 실험실에서 네 일상적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼의 사용을 설명합니다. 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 모두 노포 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 기술에서 유도되는 반면, 전자는 즉석에서 6 × 6 십자 통해 병렬 후자 선물 반면 36 반응 반점, 직렬 흐름 구성 형태로 연결된 네 개의 플로우 셀을 갖고 미세 유체 채널 구성. 비스 MX96은 공간 방향에서 검출을 제공하는 추가의 촬상 기능은 SPR 센서 기술을 기반으로 동작한다. 연속 흐름 Microspotter (CFM)와 결합이 검출 기술은 전자에 의해 크게 처리량을 확대동시에 반응 96 개 스포츠 다중 어레이 인쇄 및 감지 nabling. 대조적으로 옥텟 RED384는 광섬유 프로브 간섭 패턴을 검출하는 바이오 센서의 역할과 BioLayer 간섭계 (BLI) 광학 원리에 기반은 팁 표면에서 상호 결합에 바꾼다. 표면 플라즈몬 공명 기반 플랫폼과는 달리, BLI 시스템은 연속 흐름 유체에 의존하지 않는다; 그들은 오비탈 교반 중에 384- 웰 마이크로 플레이트의 분석 용액에 침지하면서 대신, 센서 팁 판독을 수집한다.
이러한 바이오 센서 플랫폼은 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 1 분자 상호 작용 모델 : 상기 설명한 프로토콜은 단순한 1 맞 항체 – 항원 동력학을 특성화하기 위해 동일한 분석 포맷과 동일한 고품질의 시약을 사용하여 실험을 보여 질 운동 데이터를 제공하기 위해 이러한 기기 능력의 직접적인 비교를 제공한다 .
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 일대일 비교 연구는 각 바이오 센서 플랫폼은 자신의 강점과 약점을 가지고 있음을 보여준다. 항체의 결합 프로파일 (도 3 – 6) 시각 비교 유사하다하더라도, 취득 된 운동 속도 상수의 순위가 악기에 걸쳐 고도의 일치 (도 7), 우리의 결과와 악기 SPR 기반 보여 연속 흐름 유체는) 느린 해리 속도와 높은 친화력 상호 작용을 해결에서 더 낫다. 해리 단계에서 상향 드리프트는 데이터 세트에서 관찰된다 (예, 항체 2, 5 항체, 단클론 항체 및 9;도 5)의 유체 BLI없는 악기에 의해 발생. 이러한 결과는 시스템의 기본 제한되는 마이크로 플레이트, 경시 시료 증발에 상당 부분 기인 할 수있다. 이 고유 한 한계로, 실험 시간은 12 시간 이하로 제한되고; 실험 따라서 쉬로 프로그램 된배의 orter 다른 플랫폼들 (10 분 및 45 분 연관 해리)에 비해 (500 S 협회 30 분간 해리). BLI 기반기구에 의해 생성 된 속도 상수가 오프 비율의 일부 변동의 결과 (도 8의 (c)으로서 이하의 선형성을 표시하지만, 실험 시간을 단축하여 데이터 품질 / 일관성 증발의 영향을 완화하기 위해 나타나지 않았다 ). 시료 증발에 더하여, 사용되는 캡쳐 시약의 차이는 또한 얻어지는 결과의 차이에 기여 할 수있다. 단백질 A / G가 세 유체 기반 SPR 플랫폼에 사용되는 동안, AHC 센서는 비 유체의 BLI 플랫폼에서 사용되었다. 단백질 A / G가 AHC 항체 기반의 바이오 센서의 표면, 단백질 A / G 표면에서 항체 – 항원 복합체의 오프 속도 인위적보다 빨리 나타나는 않는보다 mAb에 대한 강한 친 화성을 가질 가능성이 있기 때문에 AHC 표면으로부터 얻어진. 이러한 가능성은 b를 지원설명 y BLI 플랫폼에 의해 발생 된 오프 속도 값은 다른 장치 (도 7의 적색 선)에 의한 것보다 더 지속적으로 낮았다 것을 보여주는 실험 데이터. 그럼에도 불구하고, BLI 플랫폼은 다른 플랫폼에 걸쳐 서로 다른 장점이 있습니다. 예를 들면, 즉시 사용으로 인해 다양한 사전 – 코팅 센서 센서 선택 및 분석에 관한 구성이 매우 유연하다. 우리의 실험에서 AHC 센서의 사용은 준비 시간을 줄이고, 리간드의 고정화 단계의 필요성을 제거. 또한, BLI 플랫폼은 복잡한 튜브 및 가치 스위치 구성을 특징으로 다른 유체의 SPR 플랫폼에 비해 훨씬 적은 유지 보수를 필요로한다. 이 기능은 막힘 오염 문제가 발생할 수 있습니다 원유 샘플을 포함하는 실험 장점이다.
치료 후보 증가, 효율적으로 신속하고 정확한 식별에 대한 수요, BI에 대한 요구로osensor 처리량도 증가하고있다. 네 개의 바이오 센서 플랫폼 중에서 96 리간드 어레이 인쇄 할 수있는 바이오 센서의 처리량 궁극적 증가 십자 36 리간드 포맷 및 16 채널 동시 판독과 BLI 기반 바이오 센서에 결합 된 바이오 센서, 다음으로 높은은 각각 96, 36, 16, 단일 결합 사이클에서 측정 된 상호 작용의 수. 이 처리량 기능은 하나의 일련의 흐름에 의해 연결된 네 개의 흐름 세포를 가지고에 의해 제한되는 기존의 SPR 플랫폼보다 훨씬 더 높다. 우리의 실험은 긴 해리 시간으로 다수의 표면 밀도에서 평가 10 단클론 항체의 비교적 작은 샘플 세트를 포함하기 때문에, 악기 처리량은 실험의 효율성을 결정하는 중간 역할을했다. 이 세 개의 높은 처리량 플랫폼의 실험 시간에 유의 한 차이는 없었다, 그리고 모든 경우에 실험은 하루에 완료되었습니다. 한편, 기존의 직렬 흐름 SPR 실험은 설치 후 데이터 수집의 도보 거리에 자동화에도 불구하고, 완료 삼일이 필요합니다. 오프 속도 순위 / 운동 검사 또는 에피토프 비닝 (binning)을 위해, (수백 또는 수천의 예) 샘플의 큰 숫자를 포함하는 다른 연구에서, 처리량은 중요한 요소가된다.
IBIS MX96의 처리량이 다른 바이오 센서보다 수십 배 더 높다 따라서 이러한 목적을위한 최적의 선택이지만, 몇 가지 단점을 가지고있다. 특히, CFM하여 배열 인쇄 큰 표면 불일치 (도 1) 및 감소 된 데이터 재현성 (도 8D 및 8E)을 나타낸다. 정확한 동역학 측정을 위해 바이오 센서의 표면 리간드의 양은 결합 반응은 같은 보조 요소들에 의해 방해되지 않도록 제어 할 필요가 중요한 파라미터이다물질 전달 또는 입체 장애. 바이아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 들어, 최적의 R L 레벨이 연구 제 17에서 설명한 바와 같이 설정된 R의 최대 값의 표준 계산에 기초하여 결정 하였다. 한편, 옥텟 RED384 및 IBIS MX96 플랫폼, 단클론 항체 캡쳐 레벨은 경험적 상수 배에서 2 배 희석 한 항체의 시리즈를 사용하여 달성 하였다. 기술 또는 캡처 단계의 제어의 부족은 고밀도 표면 운동 속도 상수의 정밀도를 손상 수도 높은 결합 응답 신호 (도 2)였다. 재생성 관련된 여러 바인딩 사이클 측정을 수행 할 때 또한, SPR 검출기로부터 프린터의 분리도 문제를 제시한다. 멀티 사이클 동역학 설정을 수행 할 수있는 유일한 방법은, 고정 된 단백질 A / G에서 단클론 항체를 통해 캡처 된 Fc 반대로 모노클 직접 아민 커플 링으로했다다른 세 개의 바이오 센서 플랫폼의 표면. 결과적으로, 추가로 재생 정찰 실험 최적의 재생 조건을 결정하기 위해 필요했다. 이 설정의 결과는 더 이상 실험 시간 이외에의 Fc 캡처 방법 (그림 9)에 비해 ~ 90 % 낮은 관찰 된 표면 활동과 연결되었다. 은 FC 캡처 방법을 실행하려면, 다른 하나의주기 운동 방식이 채택되었다. 이러한 접근법은 각각의 분사 (도 2) 사이에 재생하지 않고, 증가하는 농도의 분석 물질의 연속 주입을 포함한다. 이것은 매우 편리하지만, 일반적으로 덜 적용 방법뿐만 실험 시간 단축 및 시약의 소비를 줄일뿐만 아니라 다른 바이오 센서 (도 7)의 것과 매우 유사한 운동 속도 상수를 생성. 따라서,이 단일 사이클 반응 속도 접근 방식을 적용하면 악기의 고유 한 구성의 한계를 극복하고 선물높은 처리량 방식으로 고해상도의 운동 속도 상수를 얻기위한 기회를 제공합니다.
처리량이 비아 코어 T100의 주요 제한에도 불구하고, 우리의 결과는 총체적으로는 최고의 품질과 가장 일치하는 데이터를 생성 한 것으로 나타났다. 이것은 ~ 10 배 높은 처리량을 가지고 ProteOn XPR36,으로 이어졌습니다. 악기 '검출 한계에 도달하면 기술적으로 어려울 수 고친 화성 항체 – 항원 상호 작용을 특성화 할 때 고품질의 데이터를 생성하는 능력이있는 장점이된다. 옥 테트 RED384의 장비의 체계적인 제한 해리 속도 상수의 정확한 측정을 방해하는 동안 (즉, 감도의 짧은 떨어지는 속도가 느린 오프 요금에 대한 충분한 신호 부패를 해결하기 위해), 모두 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36는 민감하고 안정적인 제공 할 수 있습니다 차별화를위한 탐지.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 IBIS MX96에 대한 기술 지원을 노아 디토 아담 마일 감사합니다.
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
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