İnguinal Yağ Yastıklarında Basal ve Forskolin ile uyarılmış Lipoliz Ölçümleri
Özet
Bu protokol, normal yem diyetinden (NCD) veya yüksek yağlı diyetten (HFD) ± kapsaisin ile beslenen vahşi tipli farelerde elde edilen kasık yağ tabletlerinde bazal ve forkolinin uyardığı lipoliz belirleme metodunu açıklamaktadır. Lipoliz için bir indeks olarak, inguinal yağlı yağ pedlerinden gliserol salınımı ölçülmüştür.
Abstract
Lipoliz, yağ dokularında trigliserit olarak depolanan lipitin, gliserol ve yağ asitlerine hidrolize edilmesiyle ilgili bir işlemdir. Bu makale, normal yemeklik diyet (NCD), yüksek yağlı diyet (HFD) ya da 0.01'i içeren yüksek yağlı bir diyet ile beslenen vahşi tipli farelerden izole edilen kasıktaki yağ yastıklarında bazal ve forskolin (FSK) uyarılmış lipolizin ölçülmesine yönelik yöntemi açıklamaktadır % Kapsaisin (CAP; geçici reseptör potansiyeli vaniloid altfamilı 1 (TRPV1) agonisti) 32 hafta boyunca. Ex vivo lipoliz gerçekleştirmek için burada tarif edilen yöntem Schweiger ve ark. 1 UV-Görünür (UV / VIS) spektrofotometri ile gliserol düzeylerini ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Burada açıklanan yöntem, tutarlı sonuçlar elde etmek için kasık yağ pedlerinin lipoliz ölçümleri için başarıyla izole edilmesi için kullanılabilir. Kasık yağ pedleri için tanımlanan protokol, diğer dokulardaki lipolizin ölçülmesi için kolaylıkla genişletilebilir.
Introduction
Yağ dokuları yağ 2 olarak enerji depolarlar ve termojenez 3 , 4 için yağ asidi oksidasyonu gerekir. Diyetle yutulan yağ asitleri apoproteinler ile birlikte şilomikronlara paketlenir ve kan dolaşımıyla vücuttaki farklı dokulara aktarılır. Vücuttaki çoğu hücrenin bir enerji rezervi depolamasına rağmen, yağ dokusu yağ olarak fazla enerji depolar 5 , 6 . Yağ dokusundaki lipoliz kompleks proseslerle düzenlenir ve lipolizin moleküler detayları halen belirsiz kalmaktadır 7 .
Lipoliz, yağ dokusunda depolanan trigliseridlerin (TGL), yağlı trigliserid lipaz (ATGL) 8 enzimi ile gliserol ve yağ asitleri (FA) üretmek üzere hidrolizlenmesiyle oluşan bir işlemdir. Bazal ve uyarılmış lipolizdeki değişiklikler obezitenin karakteristik bir özelliğidir. BAsal lipoliz, TGL'yi diasilgliserol (DAG) haline getiren, daha sonra monoasil gliserole (MAG) hidrolize edilen ATGL aktivasyonu 9 ile düzenlenir. Adenillyla siklaz yoluyla hormona duyarlı lipazın (HSL) aktivasyonu siklik adenozin monofosfat (cAMP) bağımlı protein kinaz A (PKA) uyarılmasını aktive eder ve lipolize neden olur. Bu nedenle, bazal ve uyarılmış lipoliz ölçümü, bu prosese dahil olan proteinlerin aktivitesini analiz etmek için önemlidir. Ayrıca, lipoliz moleküler düzenleme çözülüyor obezite 10 karşı yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi faydalı olabilir. Lipoliz ve yağ asidi oksidasyonunu uyaran moleküller, depolarda depolanan yağları azaltmak için potansiyel aday olduğundan, tekrarlanabilirlik için sağlam bir test kullanmak önemlidir.
Daha önce yayınlanmış veriler, beyaz yağ dokusunda ifade edilen TRPV1 proteininin CAP ile güçlendirilmiş bazalVe kasık yağ pedlerinde FSK (adenillyla siklaz aktivatörü) uyarılmış lipoliz 11 . Önceki araştırmalar ayrıca, TRPV1'in CAP tarafından uzun süreli aktive edilmesinin PKA 12'yi aktive ettiğini ileri sürmektedir. PKA'nın aktivasyonu, lipozizi uyardığından , 13 , 14 , ilgili diyetlerin beslenmesinden 32 hafta sonra NCD veya HFD (± CAP) ile beslenen farelerden izole edilmiş kasık yağ pedlerinde bazal ve PKA'ya bağlı uyarılmış lipolizin ölçülmesiyle TRPV1'in rolü doğrulanacaktır Lipoliz aktivasyonu.
Bu makale, bazal ve uyarılan lipolizin belirlenmesinde etkili bir yöntem anlatmaktadır. Gliserolün radyoaktif izotoplarını kullanan diğer yöntemler ve ölçümler 15 , 16 için sıkıcı yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya gaz kromatografisi / kütle spektrometresi mevcut olsa da, bu yöntem daha doğrudan, basit ve uygun maliyetli bir yöntem sunmaktadırYağ dokusundaki lipolizi belirleme tekniği.
Protocol
Representative Results
Discussion
TGL'nin gliserol ve yağ asitleri haline dönüşümü, bazal lipoliz sırasında ATGL 9 ile katalize edilir ve uyarılan lipoliz 21 , 22 , 23 sırasında adenil siklaz / PKA'ya bağımlı yolağın aktivasyonu da dahil olmak üzere bir dizi protein ile düzenlenir. Lipolizin arttırılması, ulaşım ve enerji kullanımı için yağ asitlerinin plazma seviyelerini arttırır 24…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, AHA Ödülü No. 15BGIA23250030, NIH Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü, 8P20 GM103432-12 ödülü ve Wyoming Üniversitesi Teknik Destek Bursu adı altında BT tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
Referanslar
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
