Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Липидные капли имеют высокие динамические цитоплазматические (и ядерные) органеллы клеток , состоящие из сердцевины нейтральных липидов (триглицериды (ТГ) и холестерин эфир (С)) приложен монослоем фосфолипидов со встроенными белками ^1. Все типы клеток производят липидные капли, но они различаются по размеру, составу липидов и белков украшения. Липидные капли выполняют различные функции, в том числе, выступающие в качестве энергии и предшественников мембраны резервуаров или в виде белковых отложений. Кроме того, через поглощение липидов, они защищают клетки от Липотоксичности, липиды высвобождения в качестве сигнальных молекул, и участвуют в деградации белков и эндоплазматический ретикулум (ЭР) реакции на стрессе ^2. Таким образом, множество белков связываются с липидных капель и регулируют их генерации, деградацию, торговлю, и взаимодействие с другими органелл. Среди них perilipin семейство добросовестных связывающих белков липидной капельки (PLIN1-5)е "> 3.

Липидный капли биогенез вероятно , начинается в ER, где ER-резидентов ферменты катализируют синтез нейтральных липидов , которые накапливаются внутри мембранного бислоя, образуя линзу нейтральных липидов, процесс , который недавно был визуализирован красиво в дрожжах ^4. Мембрана изгиба и повышенные уровни фосфатидной кислоты и диацилглицерина затем думали , чтобы привлечь белки , участвующие в биосинтезе фосфолипидов, как одновременное синтеза основных нейтральных липидов и фосфолипидов экранирующих требуются для выработки липидов капели ^5. Ферменты, несущие трансмембранные домены, которые находятся в ER катализирует этот процесс. Экспансия крупных липидных капель требует активности другого класса липидов синтеза ферментов, которые укрывают амфипатическую спираль и таким образом перемещаются из ЭР в липидных капель. Мобилизации липидов из липидных капель происходит за счет локальной активации triglyceridе и диацилглицерин липаза жировая ткань триглицерид липаза (ATGL) и гормон-чувствительная липаза (HSL) или различными пути аутофагии, такие как макро- и microlipophagy или шаперон-опосредованная аутофагия ^6. Липидные капли взаимодействуют с другими клеточными органеллами, такие как митохондрии (для беты-окисления и синтеза липидов) и ER (для синтеза липидов и торговли белком), но и с лизосомами, эндосыми и вакуолей , вызванной внутриклеточными бактериями ^7. Действительно бактерии, вирусы, паразиты и даже предназначаться липидные капли для репликации и упорства, среди них ⁸ HCV.

ВГС – инфекция является одной из ведущих причин печени , связанные с заболеваемостью и смертности во всем мире, что составляет около 0,5 миллиона смертей в год ^9. Истинное число инфекций HCV неизвестно, но недавние оценки показывают, что 130 – 150 миллионов людей хронически инфицированы. Нет vaccinе существует, но недавно утвержденное прямое действие противовирусных значительно увеличить терапевтические реакции по сравнению со стандартной терапией интерферона основой. Тем не менее, во всем мире, лечение больных, вероятно, будет ограничено из-за чрезвычайно высокой стоимости новых терапевтических средств. Около половины всех лиц, хронически инфицированный вирусом гепатита С развитием жировой болезни печени (стеатоз), состояние, характеризующееся избыточным накоплением липидных капель в гепатоцит. Интересно, что липидные капли также становится жизненно важные клеточные органеллы для репликации HCV, предполагаемо , выступающей в качестве вирусных сборочных участков ^{10, 11.}

В HCV-инфицированных клетках, вирусный белок ядра и NS5A локализуются в липидных капель в процессе , который зависит от биосинтеза триглицеридов, в качестве ингибиторов диацилглицерол ацилтрансферазы-1 (DGAT1) ухудшать оборотом в липидных капель и последующего производства HCV ¹² частиц </sup^{>, 13, 14, 15.} Кроме того, мутации в липидных капельных-связывающих доменов либо ядра или NS5A подавить сборку HCV ^{16, 17.} Сердечник и NS5A затем набирать все другие вирусные белки, а также комплексы репликации вирусной РНК, с мембранами , тесно связанных с липидом капель ^16. Согласованные действия всех вирусных белков требуются для успешного производства инфекционного вирусного потомства ^{10, 11.} Структурные белки являются частью вирионов, и неструктурные белки способствуют белок-белковых взаимодействий, необходимых для этого процесса. Интересно, что добросовестные липидный капелька-связывающий белок PLIN3 / TIP47 необходим как для HCV репликации РНК и высвобождение вирионов ^{18, 19} <suр>, ^20. Несмотря на эти последние достижения, механистические детали, особенно на вирус-хозяин взаимодействий в поздних стадиях репликации вируса гепатита C, по-прежнему плохо определены, и точная функция липидных капель неизвестна.

Здесь мы описываем способ, чтобы изолировать липидные капли для количественного масс-спектрометрии ассоциированных белков. С помощью этого метода, мы обнаружили глубокие изменения в протеоме липидов капели во время инфекции HCV и определил аннексин A3 в качестве хоста – белка , который со-фракционирование с липидным капель и требуется для созревания эффективности HCV ^21.