Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Vetdruppels die aan snelle veranderingen cytoplasmatische (nucleus) celorganellen bestaande uit een kern van neutrale lipiden (triglycerides (TG) en cholesterol ester (CE)) omsloten door een monolaag van fosfolipiden met ingebedde eiwitten ^1. Alle soorten cellen produceren vetdruppels, maar ze variëren in grootte, lipidesamenstelling, en eiwitten decoratie. Vetdruppels vervullen verschillende functies, waaronder het dienen als energie en membraan precursor reservoirs of eiwitafzettingen. Bovendien, door de opname van lipiden, zij beschermen cellen tegen lipotoxicity, afgifte lipiden zoals signaalmoleculen en zijn betrokken bij eiwitafbraak en endoplasmatisch reticulum (ER) stressrespons ^2. Als zodanig kan een groot aantal proteïnen binden aan vetdruppels en bepalen hun generatie, afbraak, handel en interactie met andere organellen. Onder hen zijn de perilipin familie van bona fide lipide druppel bindende eiwitten (PLIN1-5)f "> 3.

Lipide druppeltje biogenese waarschijnlijk vanaf het ER, waarin ER-resident enzymen katalyseren de bereiding van neutrale lipiden die zich ophopen in het membraan bilaag, waardoor een lens van neutrale lipiden, een werkwijze die onlangs mooi werd zichtbaar in gist ^4. Membraan buigen en verhoogde fosfatidinezuur en diacylglycerol niveaus worden vervolgens gedacht dat eiwitten die bij fosfolipide biosynthese aantrekken de gelijktijdige synthese van de kern neutrale lipiden en fosfolipiden afscherming nodig is voor lipide droplet generation ^5. Enzymen huisvesten transmembraandomeinen die de ER bevinden dit proces katalyseren. Uitbreiding naar grote vetdruppels vereist de activiteit van een andere klasse van lipide-synthetiserende enzymen die een amfipathische helix haven en dus reizen van het ER naar vetdruppels. De mobilisatie van lipiden uit vetdruppels gebeurt via de lokale activatie van het triglyceridee en diacylglycerollipasen adipose triglyceride lipase (ATGL) en hormoongevoelige lipase (HSL) of door verschillende autofagocytische routes, zoals macro- en microlipophagy of chaperonne-gemedieerde autofagie ^6. Lipidedruppeltjes interactie met andere cellulaire organellen, zoals mitochondriën (voor beta-oxidatie en lipidesynthese) en ER (voor lipidesynthese en eiwittransport), maar ook met lysosomen, endosomen en vacuolen geïnduceerd door intracellulaire bacteriën ^7. Inderdaad bacteriën, virussen, en zelfs parasieten richten vetdruppels voor replicatie en persistentie, waaronder HCV ^8.

HCV-infectie is een van de belangrijkste oorzaken van lever-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit wereldwijd, goed voor ongeveer 0,5 miljoen doden per jaar ^9. Het werkelijke aantal HCV-infecties is onbekend, maar recente schattingen suggereren dat 130-150.000.000 mensen chronisch geïnfecteerd. geen vaccine bestaat, maar de onlangs goedgekeurde direct-werkende antivirale middelen drastisch verhogen van de therapeutische respons vergeleken met de standaard-interferon gebaseerde therapie. Echter, de hele wereld, de behandeling van patiënten zullen waarschijnlijk worden beperkt als gevolg van de extreem hoge kosten van de nieuwe therapieën. Ongeveer de helft van alle personen die chronisch geïnfecteerd zijn met HCV te ontwikkelen leververvetting (steatose), een aandoening gekenmerkt door de buitensporige accumulatie van vetdruppels in levercellen. Intrigerend vetdruppels voren tevens als vitale cellulaire organellen voor HCV-replicatie, vermoedelijk dienende virale assemblagesites ^{10, 11.}

In HCV-geïnfecteerde cellen, het virale eiwit en NS5A kern lokaliseren lipide druppeltjes in een proces dat afhangt triglyceridebiosynthese, als remmers van diacylglycerol acyltransferase-1 (DGAT1) aantasting handel lipide druppeltjes en daaropvolgende HCV deeltjesproducie ¹² </sup^{>, 13, 14, 15.} Bovendien mutaties in het lipide-droplet bindende domeinen van zowel kern- of NS5A onderdrukken HCV samenstel ^{16, 17.} Kern en NS5A rekruteren dan alle andere virale eiwitten, alsook virale RNA-replicatie complexen membranen nauw verbonden met vetdruppels ^16. Een samenspel van alle virale eiwitten is vereist voor de succesvolle productie van infectueuze virale nakomelingen ^{10, 11.} De structurele proteïnen zijn deel van de virions, en de niet-structurele eiwitten bevorderen eiwit-eiwitinteracties vereist voor dit proces. Intrigerend is de bona fide lipide-droplet bindingseiwit PLIN3 / TIP47 vereist zowel HCV-RNA-replicatie en afgifte van virions ^{18, 19} <sup>, ^20. Ondanks deze recente ontwikkelingen, de mechanistische gegevens, in het bijzonder van het virus-gastheer interacties tijdens de late stadia van HCV replicatie, blijven slecht gedefinieerd, en de precieze functie van de vetdruppels is onbekend.

Hier beschrijven we een werkwijze voor vetdruppels te isoleren voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten. Met deze methode, hebben we diepgaande veranderingen in het lipide druppel proteoom tijdens HCV infectie en geïdentificeerd annexine A3 als gastheer eiwit dat co-fractioneert met vetdruppels en is vereist voor efficiënte HCV rijping ^21.