هنا، نقدم إجراء لأداء على نطاق واسع كا 2 + التصوير مع الخلوية القرار عبر طبقات القشرية متعددة في الفئران تتحرك بحرية. ويمكن ملاحظة مئات من الخلايا النشطة في وقت واحد باستخدام مصغرة، المجهر محمولة على الرأس إلى جانب مسبار المنشور زرع.
في الدائرة الحية والمستوى الخلوي التصوير الوظيفي هو أداة حاسمة لفهم الدماغ في العمل. وقد وفرت التصوير عالية الدقة من الخلايا العصبية الماوس القشرية مع اثنين من الفوتون المجهري رؤى فريدة من نوعها في هيكل القشرية، وظيفة واللدونة. ومع ذلك، تقتصر هذه الدراسات على رأس الحيوانات الثابتة، والحد بشكل كبير من التعقيد السلوكي المتاحة للدراسة. في هذه الورقة، ونحن تصف إجراء لأداء المجهري مضان المزمن مع الخلوية القرار عبر طبقات القشرية متعددة في الفئران تتصرف بحرية. استخدمنا المجهر مضان متكامل مضغوط يقترن مسبار المنشور زرع لتصور في وقت واحد وتسجيل ديناميات الكالسيوم من مئات الخلايا العصبية عبر طبقات متعددة من القشرة الحسية الجسدية كما الفأر تعمل في مهمة استكشاف كائن رواية، على مدى عدة أيام. هذه التقنية يمكن أن تتكيف مع مناطق الدماغ الأخرى في أنواع حيوانية مختلفة ل p السلوكية الأخرىaradigms.
القشرة هي لاعب أساسي في العديد من الوظائف العقلية والسلوكية المعقدة، من الانتباه، الإدراك الحسي والسيطرة على المعرفي من أعلى إلى أسفل 1 ، 2 ، 3 إلى التحفيز والمكافأة، والإدمان مسارات 4 ، 5 . فهم العمليات الحسابية التي تكمن وراء وظيفتها هو هدف مهم لدفع فهم السريري أفضل من العديد من الاضطرابات النفسية والسلوكية.
العديد من النظريات الحالية من الأمراض النفسية مركز حول فكرة أن القشرية ضعف الدائرة العصبية أو ديسكورديناتيون قد تكمن وراء الشذوذ المعرفي والسلوكي التي هي السمات المميزة لظروف مثل الفصام 6 ، التوحد 7 أو اضطراب الوسواس القهري 8 . وبالتالي، الحصول على مستوى السكان بيانات النشاط العصبي من المشاركوالدوائر التحليلية ضمن السياق السليم للمعلومات السلوكية المتزامنة ذات أهمية كبيرة، ومن الناحية المثالية يمكن أن تستهدف أنواع محددة من الخلايا لأقوى تشريح الدائرة العصبية.
المجاهر مصغرة بالتزامن مع زرع الانكسار مؤشر الانكسار (غرين) ميكرولنسس تمكين الوصول البصري إلى الفرق العصبية تحت ظروف تتحرك بحرية من مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ الممكنة 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، بما في ذلك القشرة 14 ، 15 ، 16 . باستخدام نظام المجهري المحمول إلى جانب مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا يسمح للتصوير متسقة من السكان الخلوية نفسها تشمل مئات من الخلايا العصبية على مدى أيام إلى أسابيع في العديد من مناطق الدماغ 9 ، ويمكن أن يكونمستهدفة وراثيا لأنواع محددة من الخلايا باستخدام ناقلات فيروسية أو تقنيات المعدلة وراثيا.
كما هو معروف القشرة لدعم وظائف مختلفة والتواصل مع مناطق الدماغ المختلفة اعتمادا على موقع الخلايا داخل الصفيحة القشرية 17 ، 18 ، 19 ، ونحن مهتمون في الحصول على نشاط العصبية متعددة الطبقات في وقت واحد في موضوعات تتصرف مستيقظا. هنا علينا أن نظهر كيفية صورة مئات من الخلايا العصبية المسمى فلورزنتلي في الفئران تتصرف بحرية على مدى أيام، وذلك باستخدام المجهر مضان مضان 20 يقترن مسبار المنشور زرع، والذي يقدم وجهة نظر متعددة الطبقات من القشرة ( الشكل 1 ).
يتكون مسبار المنشور المستخدمة هنا من اثنين من العدسات غرين منفصلة: منظور وعدسة تتابع أسطواني ( الشكل 1 ). ضوء من المجهر يثير فلوريسنتلي المسمىالخلايا الموجودة على طول وجه التصوير من التحقيق المنشور، بعد أن تنعكس على الوتر من جزء المنشور من التحقيق. الضوء المنبعث من الخلايا يعكس أيضا من الوتر من المنشور، يتم جمعها من خلال الهدف من المجهر ويصل إلى أجهزة الاستشعار في المجهر. يتم تكييف مسبار المنشور المستخدمة في هذا الإجراء لسهولة استخدامها مع المعدات التجسيمي القياسية.
مضان مضان المنمنمة 20 بالكشف عن العمل المحتملين أثار كا 2+ العابرين في السكان الخلايا العصبية مع قرار خلية واحدة، بعد تلك الخلايا قد وصفت على وجه التحديد مع كا 2 + -Sensitive المؤشرات الفلورية المشفرة وراثيا. في هذا البروتوكول، ونحن حقن كا 2 + مؤشر مشفرة في ناقلات الفيروسية (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40)، زرع التحقيق المنشور، تثبيت المجهر، ثم الحصول على عدة أيام من البيانات الحسية الجسدية (S1 هند أطرافه) من حيوان يعرضد لأسطح الكائن الرواية خلال التنقيب مجانا ( الشكل 2 ).
فهم نشاط الدائرة العصبية خلال السلوك مستيقظا هو مستوى حيوي من التحقيق علم الأعصاب اللازمة لتشريح فعال وظيفة الدماغ في الصحة والمرض. القشرة هي منطقة ذات أهمية خاصة للدراسة في سياق السلوك مستيقظا، لأنها تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الحسية والمعرفية والتنفيذية الحيوية 28 ، 29 .
ويعتقد أن العمود القشرية لتكون الوحدة الوظيفية الأساسية في القشرة والنشاط على مستوى السكان من الخلايا القشرية هو معروف أن تختلف على أساس موقعها الفعلي داخل العمود. على سبيل المثال، الخلايا العصبية المثيرة في الطبقات 2/3 في مشروع القشرة الحسية الجسدية في المقام الأول إلى المناطق القشرية المخية الأخرى وتعديل الشبكات القشرية الأخرى 30 ، في حين أن الخلايا في طبقات أعمق المشروع في المقام الأول إلى المناطق تحت القشرية مثل المهاد 31 . تسجيل نشاط مائةثانية من الخلايا القشرية قبل محددة في وقت واحد وبشكل موثوق مع مرور الوقت عبر الصفيحة مختلفة في المواضيع تتصرف بحرية من شأنه أن يعزز كثيرا فهمنا لتدفق المعلومات القشرية، والسماح لتشريح وظيفي أدق من أعمدة القشرية أبلغت في الوقت الحقيقي المعلومات السلوكية والمهام ذات الصلة الوقت- النطاقات.
جمع هذا المستوى من البيانات الدائرة العصبية هو ممكن مع استخدام كفاءة ومبسطة المنمنمة المنصة المجهرية لإجراء على نطاق واسع كا 2 + التصوير في المواضيع تتصرف بحرية (أو الموضوعات رأس ثابت كما هو مطلوب). تستخدم مع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا لتمكين خلية من نوع محدد الاستهداف، والتصوير مجال متعدد الطبقات للعرض المقدمة من مسبار موشور مزروع مزروع، واستكشاف هذا البروتوكول حالة واحدة من بين العديد من التطبيقات الممكنة: مراقبة الاختلافات الصفحي في معالجة القشرية الحسية الجسدية عند الفئران جسديا تعمل مع كائن رواية ( الشكل 5 ).هذا هو التوضيح الإجرائي الأول من هذا النوع من نوع الخلية محددة، في الجسم الحي نهج لدراسة طبقات القشرية متعددة في مستيقظا، الحيوانات تتصرف بحرية، ويوسع الطيف من الأساليب التجريبية المتاحة لفهم الهياكل الصفحي في الدماغ النشط.
مجال الرؤية المنظار من تمكين مسبار المنشور في هذه التقنية يمكن تطبيقها عمليا على هياكل الدماغ الأخرى عند الحفاظ على الأنسجة مباشرة ظهري إلى منطقة من الفائدة هو المطلوب؛ على سبيل المثال، يمكن أن يتحقق التصوير CA3 دون تعطيل وظيفة الحصين.
نهج التحقيق مسبار بريزم للتصوير النشاط كا 2 + يتطلب الإدراج البدني والزرع الدائم لل ميكروبريسم في القشرة، وهو ما يعادل إنشاء الآفة القشرية حيث يتم إدراج مسبار العدسة. وهذا قد يؤدي إلى اضطرابات في الدوائر العصبية المحلية، بما في ذلك قطع التشعبات القمي والعمليات. تيفإن الإجراء له أيضا أن يسبب تفعيل الأولي للخلايا الدبقية في المنطقة، على الرغم من أن هذا من المتوقع أن تكون مترجمة إلى الأنسجة حوالي 150 ميكرون من وجه المنشور، وتهدأ بعد أن تلتئم الدماغ 22 . من المهم جدا النظر في ما إذا كانت هذه التقنية سوف تؤثر على تشريح الدائرة الطبيعية و / أو سلوك الحيوانات عند التخطيط للتجارب. وينبغي دائما إجراء مجموعات السيطرة السلوكية لضمان عدم وجود تغييرات كبيرة في السلوكيات الأساسية التي يمكن أن تنتج نتائج تجريبية مربكة.
باستخدام هذا المنمنمة، المحمول كا 2 + تقنية التصوير مع التلاعب نيوروفارماكولوجيكال، المعرفية المختلفة، والاجتماعية، والحركية أو النماذج السلوكية الجوهرية، والجمع بينها مع القياسات الفسيولوجية الأخرى يمكن تعميق وإثراء الدراسات التي تركز على فهم الأدوار الوظيفية للدوائر العصبية في السلوك والإشارة معالجة 32 . قمع أو تنشيطيمكن أن تؤثر على بعض مسارات التضمين من قبل المخدرات السلوكيات المرتبطة بها، والتي يمكن دراستها بسهولة باستخدام هذه التكنولوجيا 33 . تتفرع إلى أنواع مختلفة من الخلايا عن طريق تعديل استهداف مؤشر الكالسيوم هو تطبيق قوي ومفيد آخر، وتمكن العديد من مجموعات الإبداعية من الأدوات التجريبية لمعالجة مختلف المسائل الدائرة العصبية.
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفون أن يشكروا كل من ف. جايارامان و دس كيم و لوجر و K. سفوبودا من مشروع المؤشر العصبي المشفر وراثيا ومشروع الجينات في جانيليا ريزارتش كامبوس بمعهد هاورد هيوز الطبي على تبرعهم السخي من AAV1-GCaMP6f إلى، الجامعة، بسبب، البنسلفانيا سهم التوجيه، كور. كما يودون أن يشكروا أولسون و نيوروزينس المجهري الأساسية في جامعة ستانفورد بدعم من المعاهد الوطنية للصحة NS069375 منحة لخدمات المجهر متحد البؤر.
Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Kopf | Model 963SD | Surgery |
Stereoscope | Labomed | Prima DNT | Surgery and Imaging |
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6mm diameter) – 1/4" Jack | FHC | 40-90-5D-02 | Surgery |
Heating Pad 5 X 12.5cm | FHC | 40-90-2-07 | Surgery |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | Surgery |
Microsyringe Pump | World Precision Instruments | UMP3 model; serial 155788 F110 | Surgery |
NanoFil 10μL Syringe | World Precision Instruments | NANOFIL | Surgery |
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK | World Precision Instruments | NF35BV-2 | Surgery |
Omnidrill35, 115-230V | World Precision Instruments | 503598 | Surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
nVista | Inscopix | 100-001048 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-1-PV3435 | Surgery |
Ketoprofen | Victor Medical | 5487 | Surgery |
Carprofen | Victor Medical | 1699008 | Surgery |
Isoflurane | Victor Medical | 1001054 | Surgery |
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm) | Pfizer (Fisher Scientific) | NC9841478 | Surgery |
Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Surgery |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Surgery |
Dissecting knives | Fine Science Tools | 10055-12 | Surgery |
ProView Implant Kit | Inscopix | 100-000756 | Surgery and Imaging |
ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length | Inscopix | 100-000592 | Surgery and Imaging |
Kwik-Sil adhesive pack of 2 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Surgery |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Surgery and Imaging |
Miniature Optical Mounting Post | Newport | M-TSP-3 | Imaging |
Microscope Baseplate | Inscopix | BPL-2 | Imaging |
Microscope Baseplate Cover | Inscopix | BPC-2 | Imaging |