Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili<em> Drosophila</em> Larva
Özet
Burada Drosophila larvalarının soğuk nosisepsiyon incelemek için yeni bir test göstermektedir. Bu deney, bir fokal zararlı soğuk uyan uygulamak edebilen özel bir dahili Peltier prob kullanır ve ölçülebilir soğuk belirli bir davranış ile sonuçlanır. Bu teknik, soğuk nosisepsiyon başka hücresel ve moleküler diseksiyon sağlayacaktır.
Abstract
Nasıl organizmalar algılayıp hala tam olarak anlaşılamamıştır zararlı sıcaklıklara yanıt verirler. Bundan başka, örneğin periferik nöropati veya hasar kaynaklı hassasiyete geçiren hastalarda duyu makine hassasiyete, altında yatan mekanizmalar iyi karakterize değildir. Genetik olarak uysal Drosophila modeli, zararlı ısı tespiti için gerekli hücreleri ve genlerin çalışma için kullanılmıştır hangi ilgi birden fazla korunmuş genleri vermiştir. Küçük hücreler ve zararlı soğuk algılama için önemli reseptörler hakkında ancak bilinmektedir. Drosophila soğuk sıcaklıklarda (≤10 ºC) uzun süre maruz hayatta etmez ve zararlı soğuk uyarıcıları onlar anlamda nasıl davranış tercihi deneylerde, daha sıcak sıcaklıklar tercih serin önlemek ve muhtemelen önleyecektir rağmen ancak son zamanlarda incelendi.
Burada tarif ve ilk zararlı soğuk (≤10 ºC) davranışsal tahlil karakterizeDrosophila. Bu aracı ve analizi kullanarak, kalitatif ve kantitatif olarak soğuk nosiseptif davranışlar değerlendirmek için nasıl bir müfettiş göstermektedir. Bu hastalık, yaralanma ya da duyarlılık bağlamında muhtemelen normal / sağlıklı kültür koşulları altında yapılabilir ya da edilebilir. Bundan başka, bu deney thermosensation, ağrı veya nosiseptif duyarlılığın etkileyebilir istenen genotipler, seçilen larvalarına uygulanabilir. ağrı ayrıca muhtemelen omurgalılar dahil diğer türlere, ağrı süreçlerinin önemli bir anlayış toplamaktadır olacak ısı nosisepsiyon incelemek için bu tahlil kullanılarak, yüksek düzeyde korunmuş bir süreç olduğu göz önüne alındığında.
Introduction
Drosophila yeni korunmuş genler ve karmaşık davranışlar temelinde yatan nöronal devrelerin tanımlanması için yüksek ölçüde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sinekler gelişmiş bir genetik araç ve nosisepsiyon 5, 6, 7 hücresel ve moleküler bazları incelemek için genetik ve nöronal manipülasyon, 1, 2, 3, 4 izin basitleştirilmiş sinir sistemi sağlar. Larvalar, yumuşak bir dokunuş 8, 9, 10, zararlı ısı 11, 12, 13 ve zararlı uyarıcıya 4 mekanik hissi için davranışsal deneyleri göz önüne alındığında, bu analizler için özellikle yararlıdır </sup> 11 zaten kurulmuş ve şeffaf larva kütikül epidermis ve altta yatan duyusal nöronların canlı veya sabit görüntüleme için izin verir edilmiştir. Son zamanlarda, zararlı soğuk için bir tahlil de burada daha detaylı olarak tarif 7, geliştirilmiştir.
Ince, konik uçlu soğuk probu kullanarak, göstermektedir, ya da sert bir mekanik ya da yüksek sıcaklık uyaranlara 7, 8 sonra, 11 Drosophila larvaları sergilerler yumuşak bir dokunuş sonrasında normal hareket sırasında gözlenen davranışlar farklıdır soğuk spesifik reaktif davranışlar, bir dizi olduğu . Soğuk özgü davranış sağlam bir tam vücut kasılması (BT), bir U-şekli (ABD) içine arka segment (PR) ve ön eş zamanlı bir zam ve posterior segment 45-90º zam bulunmaktadır. Bu davranışların sıklığı düşen sıcaklıklar ama s, her tepe ile artarHafif farklı soğuk sıcaklıklarda. Son çalışmalar, BT tepkileri zararlı ısı veya sert mekanik uyarıcılara 7 cevap verdiği, bu daha farklı, periferal sensor nöronların aracılık olduğunu göstermektedir.
Çok omurgalı nosiseptörlerin gibi, Drosophila birden fazla dendritik (md), periferal duyu nöronları epidermis üzerinde 1 arborize kompleks dentritik yapılara sahiptir. MD nöronlar ventral sinir kablosu 14 aksonları çıkıntı, her larva gövde bölümünün içinde mevcut bulunmaktadır. MD duyu nöronları dendritik morfolojiye göre dört farklı sınıflarına (I-IV) ayrılır ve duyusal fonksiyonları 4, 9, 10, 15, 16, 17 değişken adres. sınıf IV nöronlar larva lateral vücut rulo tepkileri için gerekli ikenyüksek sıcaklıklarda veya sert mekanik uyarıcılara 4, sınıf III nöronlar yumuşak bir dokunuş yanıtları 9, 10 için gereklidir ve sadece soğuk ile aktif hale getirilmediği, fakat aynı zamanda soğuk uyarılmış davranışsal tepkileri 7 için gereklidir. Her iki sınıf III ve sınıf IV nöronlar uyaranlara 9, 10, 17, 19 7, 11, 18, zararlı ve zararlı olmayan davranışsal tepkileri kolaylaştırmak ayrı geçici reseptör potansiyel (TRP) kanal kullanmaktadır. Bundan başka, larva nosisepsiyon 20, hücresel ve davranış seviyelerinde 12, 21, aşağıdaki yaralanması hassaslaştırılır.
Burada tarif edilen deney, quantificatio sağlarNormal ya da potansiyel iki n ortam sıcaklıklarında (18-22 ° C) için, zararlı soğuktan (10 ° C '≤) kadar düşük sıcaklıklarda, zararsız serin (11-17 ° C) için davranışsal tepkileri değiştirmiştir. Bu tahlilde kullanılan soğuk sıcaklıklarda, doğrudan, sınıf III duyu nöronlarını aktive edici nitelik olabilir ve niceliksel olarak 7 analiz edilebilir sağlam ve tekrarlanabilir kalsiyum artar ve soğuk uyarılmış davranışsal tepkileri ortaya çıkarma yeteneğine sahiptir. Bu deney, soğuk nosisepsiyon, nosiseptif duyarlılığın veya nosiseptif plastisite etki, genetik ve çevresel faktörlerin belirlenmesi çeşitli çevre koşullarına maruz larvası (değiştirilmiş beslenme, yaralanma, farmakolojik maddelere) yanı sıra hemen hemen herhangi bir genotip larvalarına uygulanabilir. thermosensation çok canlı üzerindeki her yerde olduğu göz önüne alındığında, bu deney, nosisepsiyon çalışma için değerli bir araç sağlar ve yeni gen hedefleri veya artıracak nöronal etkileşimleri ortaya çıkarabiliromurgalı nosisepsiyon anlayışımız.
Özel oluşturulmuş soğuk prob (soğuk prob, Malzemelerin Tablo) termal iletim yoluyla alüminyum şaft ve konik ucunu soğutur, Peltier cihazı, kontrol edilen bir kapalı döngü sıcaklığı kullanmaktadır. Termistör alüminyum konik ucu içine gömülü olduğu kontrol birimi gerçek zamanlı sıcaklığını gösterir. Bir soğutucu ve fan (Termal Kontrol Ünitesi, Malzemelerin Tablo) elde edilebilir Peltier tesir ısı yükü (Qc) böylece (22-0 ° C) istenen sıcaklık aralığı ayarlamak için termoelektrik modül eklenir. Soğuk prob ucunun zararlı soğuk uyaran, ön ve arka uçlarından eşit uzaklıktaki segmenti (lar), sırt orta çizgisi için elle uygulanır larva (kabaca kademeli A4, Şekil 1A bakınız). Soğuk uyaranlara yanıt olarak, larva genellikle 10 s kesim içinde üç soğuk hatırlattığı hareketler birini üretmek: tam gövdekasılması (BT), bir U-şekli (ABD) ya da (Sonuçlar tarif edilmiştir) arka segment (PR) bir zam içine anterior ve posterior segment bir 45-90º kaldırmak. Bu davranışların hiçbiri, normal peristaltik hareketin veya yem arama davranışı sırasında gerçekleştirilir. Bu davranışlar da yumuşak bir dokunuş tepkiler ve yüksek sıcaklık veya zararlı mekanik uyarıcılara verdikleri caydırıcı haddeleme yanıt farklıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen deney, nitel ve nicel olarak, çeşitli genetik geçmişlerde, çevresel etkiler, ve / veya hasar kaynaklı durumların larvaları nosisepsiyon veya nosiseptif hassasiyete değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu deney, bu araç ile soğuk bir uyarıcı odak uygulama için izin verdiği bir özellikle düşük ısılara yanıt, periferal sensor nöronların bir alt fonksiyonunu değerlendirmek. İlginç bir şekilde, bu soğuk uyarılmış davranışlar ısı 7,…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz eleştirel el yazması okumak için soğuk prob deneyine, sinek hisse senetleri için Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve Galko laboratuar üyelerinin erken aşamasını geliştirmek için Sarah Wu ve Camille Graham teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NRSA HNT için (NIH F31NS083306) tarafından ve NIH R01NS069828, R21NS087360 ve MJG Temel Araştırma Texas MD Anderson Clark Fellowship bir üniversite tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
Referanslar
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move – Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
