Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em> Drosophila</em> Le larve

Drosophila ha dimostrato di essere molto utile per l'identificazione di nuovi geni conservati e circuiti neuronali che sottendono comportamenti complessi. Mosche forniscono un sofisticato toolkit genetico e un sistema nervoso semplificato che permettono precisa manipolazione genetica e neuronale ^{1, 2, 3, 4} per sezionare le basi cellulari e molecolari della nocicezione ^{5, 6, 7.} Larve sono particolarmente utili per queste analisi, dato che saggi comportamentali per tocco delicato ^{8, 9, 10, 11} calore ^{nocive, 12, 13} e sensazione meccanica di stimoli nocivi ^4, </sup> ¹¹ sono già stati stabiliti, e la cuticola larvale trasparente permette l'imaging dal vivo o fisso dell'epidermide e neuroni sensoriali sottostanti. Recentemente, un saggio per freddo nocivo è stato anche sviluppato ^7, che descriveremo in maggior dettaglio qui.

Utilizzando una multa sonda fredda, conico-punta, mostriamo che Drosophila larve presentano un insieme di comportamenti reattivi specifici a freddo, distinto da comportamenti osservati durante la locomozione normale, seguito tocco delicato, o dopo duro stimolo meccanico temperatura o alta ^{7, 8, 11} . I comportamenti specifici a freddo includono un robusto contrazione tutto il corpo (CT), una 45-90º aumento dei segmenti posteriori (PR) e un aumento simultaneo del segmenti anteriore e posteriore in una forma ad U (US). La prevalenza di questi comportamenti aumenta con temperature decrescenti ma ciascuno picchi sleggermente diverse temperature fredde. Lavori recenti suggeriscono che le risposte CT sono mediati da diversi neuroni sensoriali periferici rispetto a quelle che rispondono a calore nocive o dura stimoli meccanici ^7.

Proprio come nocicettori vertebrati, Drosophila dendritiche multipla (md) neuroni sensoriali periferici hanno strutture dendritiche complesse che arborize oltre l'epidermide ^1. neuroni md sono presenti in ogni segmento corporeo larvale, proiettando loro assoni al cordone nervoso ventrale ^14. neuroni sensoriali md sono suddivisi in quattro classi differenti (I-IV) basati sulla morfologia dendritica e hanno diverse funzioni sensoriali ^{4, 9, 10, 15, 16, 17.} Mentre i neuroni classe IV sono necessari per larvali risposte rollio lateralea temperature elevate o rigide stimoli meccanici ^4, classe III neuroni sono necessari per delicato tocco risposte ^{9, 10} e non solo sono attivati dal freddo, ma sono necessarie anche per le risposte comportamentali evocati freddo ^7. Entrambi i neuroni classe III e IV utilizzano potenziali canali discreti transient receptor (TRP) per facilitare risposte comportamentali ai nociva ^{7, 11, 18} e stimoli ^{9, 10, 17, 19} non-nocivo. Inoltre, nocicezione larvale è sensibilizzato infortunio seguito, a livello cellulare ²⁰ e comportamentali ^{12, 21.}

Il saggio descritto qui consente la quantification di una normale o potenzialmente alterato risposte comportamentali a basse temperature che variano da nocivi freddo (≤ 10 ° C), freschi innocui (11-17 ° C), a temperatura ambiente (18-22 ° C). Le temperature fredde utilizzati in questo test è in grado di attivare direttamente classe III neuroni sensoriali, suscitando robusti, aumenta calcio riproducibili e risposte comportamentali evocati freddo, che possono essere qualitativamente e quantitativamente analizzati ^7. Questo test può essere applicato a larve di qualsiasi genotipo nonché di larve esposto a diverse condizioni ambientali (alimentazione alterato, lesioni, agenti farmacologici) per determinare i fattori sia genetici e ambientali che hanno un impatto nocicezione freddo, la sensibilizzazione nocicettiva e la plasticità nocicettivo. Dato che thermosensation è onnipresente in molte specie, questo test fornisce un valido strumento per lo studio della nocicezione e può scoprire bersagli gene nuovi o interazioni neuronali che migliorerannola nostra comprensione della nocicezione vertebrati.

La sonda a freddo su misura (vedi sonda fredda, Table of Materials) utilizza una temperatura controllata ad anello chiuso dispositivo Peltier, che raffredda l'albero alluminio e punta conica per conduzione termica. Un termistore è incorporato all'interno della punta conica alluminio riporta la temperatura in tempo reale sulla centralina. Un dissipatore di calore e la ventola sono fissati al modulo termoelettrico per regolare il carico del effetto Peltier calore (Qc) e quindi l'intervallo di temperatura desiderato (22-0 ° C) può essere realizzato (vedi Unità di controllo termico, Table of Materials). Lo stimolo nocivo freddo della punta della sonda freddo viene applicato a mano alla linea mediana dorsale, a segmento (s) equidistante dalle estremità anteriori e posteriori (circa segmento A4, vedere Figura 1A) della larva. In risposta a stimoli freddi, larve generalmente producono uno dei tre comportamenti evocati freddo a 10 s cut-off: un corpo pienocontrazione (CT), un aumento di 45-90º segmento anteriore e posteriore in una forma ad U (USA), oppure un aumento dei segmenti posteriori (PR) (descritto in Risultati). Nessuno di questi comportamenti vengono eseguite durante la normale locomozione peristaltica o comportamento di foraggiamento. Questi comportamenti sono anche distinti da risposte tocco delicato e la risposta di laminazione avversione ad alte temperature o nocivi stimoli meccanici.