Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación

La secuenciación del genoma es una poderosa herramienta para disecar la base genética subyacente de rasgos importantes de las plantas. La mayoría de los estudios de secuenciación del genoma se centran en el contenido del genoma nuclear, ya que la mayoría de los genes se encuentran en el núcleo. Sin embargo, los genomas organelos, incluyendo las mitocondrias (a través de eucariotas) y plastidios (en las plantas, la forma especializada, el cloroplasto, trabaja en fotosíntesis) aportan información genética significativa esencial para el desarrollo de organismos, la respuesta al estrés y la aptitud general ¹ . Genomas organelas se incluyen normalmente en el total de extracciones de ADN destinados a la secuenciación del genoma nuclear, aunque los métodos para reducir el número de organelos antes de la extracción de ADN también se emplean [ ^2] . Muchos estudios han utilizado resultados de secuenciación de las extracciones totales de gDNA para ensamblar genomas organelos ^{3 , 4 , 5 ,}Xref "> 6 ^{, 7.} Sin embargo, cuando el objetivo del estudio es centrarse en los genomas organelares, el uso del gDNA total incrementa los costos de secuenciación debido a que muchas lecturas están" perdidas "en las secuencias de ADN nuclear, particularmente en plantas con genomas nucleares grandes Además, debido a la duplicación y transferencia de secuencias organelares en el genoma nuclear y entre orgánulos, la resolución de la posición correcta de la cartografía de secuenciación lee al genoma adecuado es bioinformatically desafiante ^{2 , 8.} La purificación de los genomas organelares del genoma nuclear es uno Estrategia para reducir estos problemas.Más estrategias bioinformáticas se pueden utilizar para separar las lecturas que mapa a las regiones de homología entre las mitocondrias y los cloroplastos.

Mientras que los genomas organelares de muchas especies de plantas han sido secuenciados, poco se sabe acerca de la amplitud de la diversidad de genomas organelosDisponible en poblaciones silvestres o en piscinas de cría cultivadas. También se sabe que los genomas organelares son moléculas dinámicas que experimentan un reordenamiento estructural significativo debido a la recombinación entre secuencias repetidas ⁹ . Además, múltiples copias del genoma organelo están contenidas dentro de cada orgánulo, y múltiples organelos están contenidos dentro de cada célula. No todas las copias de estos genomas son idénticos, que se conoce como heteroplasmia. En contraste con el cuadro canónico de "círculos maestros", ahora hay evidencia creciente de una imagen más compleja de las estructuras del genoma organelar, incluidos los círculos sub-genómica, cromosomas lineales, concatamers lineales y estructuras ramificadas [ ^10] . El ensamblaje de los genomas organelares de las plantas se complica aún más por sus tamaños relativamente grandes y sus sustanciales repeticiones invertidas y directas.

Los protocolos tradicionales para el aislamiento organelar, la purificación del ADN y el subsiguiente genoma La secuenciación a menudo es engorrosa y requiere grandes volúmenes de entrada de tejido, con varios gramos a más de cientos de gramos de tejido de hoja joven necesarios como punto de partida ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} . Esto hace inaccesible la secuenciación del genoma organelo cuando el tejido es limitado. En algunas situaciones, las cantidades de semillas son limitadas, como cuando es necesario secuenciar sobre una base generacional o en líneas masculinas estériles que tienen que ser mantenidas por cruce. En estas situaciones, el ADN organelar puede purificarse y luego someterse a amplificación de todo el genoma. Sin embargo, la amplificación del genoma completo puede introducir sesgo de secuenciación significativo, que es un problema particular al evaluar la variación estructural, las estructuras sub-genómicas y los niveles de heteroplasmia> 18. Los avances recientes en la preparación de bibliotecas para tecnologías de secuenciación de lectura corta han superado barreras de entrada baja para evitar la amplificación del genoma completo. Por ejemplo, el kit de preparación de biblioteca de Illumina Nextera XT permite que se utilice tan poco como 1 ng de ADN como entrada ¹⁹ . Sin embargo, las preparaciones de bibliotecas estándar para aplicaciones de secuenciación de larga lectura, como las tecnologías de secuenciación PacBio o Oxford Nanopore, todavía requieren una cantidad relativamente alta de ADN de entrada, lo que puede representar un reto para la secuenciación del genoma organelo. Recientemente, se han desarrollado nuevos protocolos de secuenciación de larga lectura para reducir las cantidades de entrada y ayudar a facilitar la secuenciación del genoma en muestras en las que es difícil obtener cantidades de microgramos de ADN ^{20 , 21} . Sin embargo, la obtención de fracciones orgánicas puras de alto peso molecular para alimentar estas preparaciones de biblioteca sigue siendo un desafío.

BuscamosO comparar y optimizar los métodos de enriquecimiento y aislamiento de ADN organelar adecuados para NGS sin necesidad de amplificación de todo el genoma. Específicamente, nuestro objetivo era determinar las mejores prácticas para enriquecer el ADN organelar de alto peso molecular a partir de materiales de partida limitados, como una submuestra de una hoja. Este trabajo presenta un análisis comparativo de los métodos para enriquecer el ADN organelar: (1) un protocolo de centrifugación diferencial tradicional modificado versus (2) un protocolo de fraccionamiento de ADN basado en el uso de un ADN comercialmente disponible CpG-metil-binding domain protein pulldown approach ²² aplicado al tejido vegetal ²³ . Recomendamos las mejores prácticas para el aislamiento de ADN organelar de tejido de hoja de trigo, que puede ser fácilmente extendido a otras plantas y tipos de tejidos.