Özet

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

Published: April 07, 2017
doi:

Özet

ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2(GRHL2)の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行(MET)を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。

Abstract

表現型の可塑性は、細胞が一過別系統の形質を獲得する現象をいいます。癌の進行中に、表現型可塑性が侵略、普及および転移を駆動します。表現型の可塑性の研究のほとんどは、上皮由来の癌の文脈でされているが実際に、それはmesenchymal-に似た現象を受け肉腫のサブセットで、また、表現型の可塑性を示し、起源に間葉ある肉腫を、判明します上皮移行(MET)。ここで、我々は、それぞれ、順次GRHL2およびmiR-200ファミリーは、細胞形質導入およびトランスフェクションを使用して発現肉腫患者samples.Weで観察されたこのMET状現象を模倣するためのmiR-200ファミリーとgrainyhead様2(GRHL2)を含む方法を開発しました、より良い肉腫細胞におけるこれらの表現型の遷移の分子基盤を理解します。 miR-200SとGRHL2を表現肉腫細胞が強化された上皮characteristを実証しました細胞形態および上皮および間葉バイオマーカーの変化にICS。これらのメソッドを使用して今後の研究では、より良い、このような移動、浸潤、転移性の傾向、および治療抵抗として肉腫細胞にMETのようなプロセスの表現型の結果を理解するために使用することができます。

Introduction

表現型の可塑性は、細胞の表現型との間の可逆的な遷移を指し、一般に二つのタイプ、上皮 – 間葉(EMT)遷移と間葉ツー上皮移行(MET)に分割されています。この表現型の可塑性は、このような開発や創傷治癒1と多細胞生物の正常なプロセスにおいて重要な役割を果たしています。しかしながら、これらの同じ経路および遺伝子発現プログラムはまた、線維症のような疾患につながることができ、(2に概説、3、4)、癌転移(参考文献5、6、7、8に概説)。転移の間に、例えば、EMTは、細胞極性、細胞-細胞相互作用を破壊、および浸潤9,10促進します。一緒に、EMTが貢献します癌細胞の普及を促進する表現型状態秒。また、EMTはまた、癌細胞の代謝6の規制緩和、薬物抵抗11、12の開発を含む積極的な表現型を駆動する他の表現型の変化、増加腫瘍開始能13,14及び免疫回避15をホストのホストにつながります。

表現型可塑性はよく癌の進行に研究されてきました。しかし、肉腫はまた、表現型の可塑性を示します。癌における表現型の可塑性の同じドライバーのいくつかはまた、肉腫の可塑性と積極性に貢献しているかのよう興味深いことに、それが表示されます。例えば、肉腫患者からの循環腫瘍細胞(CTCのは)のEpCAM、典型的には上皮細胞16に見出される細胞表面タンパク質を発現することが示されています。 ADDItionally、250個の軟部組織肉腫サンプルは遺伝子発現に基づいて、上皮様または間葉様に分類しました。上皮様バイオマーカーの署名の患者は間葉様バイオマーカーの署名17の患者よりも良い予後を持っていました。これは、より多くの上皮様癌の患者は、より間葉様腫瘍18の患者と比較して、より良い結果を持っている多くの癌腫、と一致しています。

いくつかの肉腫は、バイオマーカーおよびMETと一致した遺伝子発現の経路を表示しますが、この表現型可塑性の分子基盤はよくわかっていないまま。肉腫にMETのメカニズムおよびドライバを研究するために、我々は2上皮固有の要因を使用してMET誘導のモデルを開発し、マイクロRNA(MIR)-200家族とgrainyheadのような2(GRHL2)。 MIR-200S messenの3' のUTRに結合することによって遺伝子発現を調節する小さな非コードRNAのファミリーでありますGERのRNAとタンパク質への翻訳を阻止します。 miR-141およびmiR-200Aを含むもの、およびmiR-200B、MIR-200C、およびmiR-429を含む他の – のmiR-200ファミリーは、2つのサブグループから成ります。 miR-200ファミリーのメンバーは、上皮組織に富んでいる、とのmiR-200Sの損失は癌19に転移と関連しています。 miR-200ファミリーはまた、正常組織20と比較して、軟組織肉腫にダウンレギュレートされます。 miR-200Sと同様に、GRHL2は、上皮の開発21のために重要である重要な調節因子です。例えばE-カドヘリンなどの上皮の遺伝子をアップレギュレートする2つの方法でGRHL2転写因子が作用する:1)上皮細胞において、GRHL2直接EMTマスタレギュレータ、ZEB1 22を抑制する。 2)GRHL2直接上皮遺伝子23の転写を活性化します。私たちの以前の研究は、肉腫細胞におけるmiR-200SとGRHL2の組み合わせ表現を示していますMET様表現型24を誘導します。ここで、我々は、miR-200SとGRHL2の異所性発現を使用して肉腫細胞におけるMET誘導のin vitroモデルを作成するための詳細なプロトコルを提示します。

Protocol

試薬の調製ウシ胎児血清(FBS)およびペニシリン – ストレプトマイシン(5,000 U / mL)をDMEMの500mLのに5mlを50ミリリットルを添加することによって、細胞培養のためのDMEMを調製します。この媒体は最大6ヶ月間4℃で保存することができます。 10μMの最終濃度にヌクレアーゼフリー水で凍結乾燥されたプライマーを再懸濁します。 -20℃で保存して再懸濁したプライマー。 放?…

Representative Results

肉腫細胞におけるMETの誘導のためのスキーマ肉腫細胞におけるMET状変化の誘導のための一般的なタイムラインは、 図1に示されています。プロトコルは、miR-200ファミリー( 図1B)のトランスフェクションに続いてGRHL2( 図1A)を 、形質導入することによって開始します。 GRHL2またはmiR-20…

Discussion

肉腫はまれですが、間葉系細胞系譜の非常に攻撃的な癌。彼らの間葉系統にもかかわらず、肉腫のサブセットは、より多くの上皮様状態への表現型の転移を起こすように見えます。より多くの上皮様腫瘍の患者は、24あまり積極的であるとして、このMET-のようなスイッチは、予後関連性を持っています。その臨床的関連性にもかかわらず、肉腫でこれらの表現型の遷移を駆?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JASはデュークがん研究所、デューク大学泌尿生殖器腫瘍学研究所、および整形外科のデューク大学の学部からの支援を認めています。 HLは、理論生物物理学のための国立科学財団(NSF)センターによってサポートされていました(NSF PHY-1427654)およびNSF DMS-1361411、およびテキサス州の癌研究におけるCPRITとして(がん予防とテキサス州の研究所)奨学生ライス大学。 KEWはメアリー・C・ファラック-カーソン、JN Onuchic、サミル・M・ハナッシュ、ケネス・J・ピエンタ、ドナルドS. Coffeyのに有用な議論の恩恵を受けたNIH F32 CA192630 MKJ及びHLによって支持されました。

Materials

Countess automated counter Life technologies AMQAX1000
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher A24811
Odyssey Fc LI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR System Thermo Fisher 4453536
PCR microplate Corning 321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit KAPA Biosystems KK4602
Starting Block (PBS) Blocking Buffer Thermo Fisher 37538 BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LE Genesee Scientific 20-102
10X Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0732 Running buffer
10X Tris/Glycine Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0734 Transfer buffer
RIPA Buffer Sigma Life Sciences SLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose GE Healthcare Lifesciences 10600012
Quick-RNA MiniPrep Kit Genesee Scientific 11-358
Laemmli Sample Buffer (4X) Bio-Rad Laboratories Inc 1610747
Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1703930
Mini-Protean Tetra Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1658005EDU
DPBS Life technologies 14190-144
0.05% Trypsin-EDTA Life technologies 11995-065
DMEM Life technologies 11995-065
Lipofectamine RNAi Max Thermo Fisher 13778150
Lipofectamine 2000 Ragents Thermo Fisher 11668019
Penicillin Streptomycin Life technologies 15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1 Thermo Fisher 4464058 neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4464066 miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200C
Opti-MEM Life technologies 11088-021 serum-free media
anti-Ecadherin antibody BD Bioscience 610182
anti-beta actin Santa Cruz Biotechnology sc-69879
anti-EpCam Ab Serotec MCA18706
anti-ZO1 Invitrogen 402200
IRDye 800W LI-COR Inc 925-32210
IRDye 680 LI-COR Inc 926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647 Thermo Fisher A211241
anti-rabbit AlexaFluor 647 Thermo Fisher ab150075
Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor Thermo Fisher 1861281
Precision Plus Protein Dual Color Bio-Rad Laboratories Inc 161-0374
Partec CellTrics Sysmex 04-004-2326 30 μm filter for flow
GAPDH-F IDT AGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-R IDT GCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-F IDT TGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-R IDT CGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-F IDT GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-R IDT CGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-F IDT GGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-R IDT CTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium  Sigma N5514
hexadimethrine bromide Sigma H9268 polybrene
3 mL syringe BD Bioscience 309657
Sterile syringe filter VWR 28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube 352063 flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher 4368814 reverse transcription kit
4% paraformaldyhyde Santa Cruz Biotechnology sc-281612
Triton-X100 Sigma 93443
bovine serum albumin Sigma A7906

Referanslar

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Ware, K. E., Gilja, S., Xu, S., Shetler, S., Jolly, M. K., Wang, X., Bartholf Dewitt, S., Hish, A. J., Jordan, S., Eward, W., Levine, H., Armstrong, A. J., Somarelli, J. A. Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. J. Vis. Exp. (122), e55520, doi:10.3791/55520 (2017).

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