Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.
Zebravis, voor het eerst geïntroduceerd als een ontwikkelingsmodel, hebben opgedaan populariteit in vele andere gebieden. Het gemak van het houden van grote aantallen snel ontwikkelende organismen, gecombineerd met de embryonale optische helderheid, diende als de eerste overtuigende kenmerken van dit model. In de afgelopen twee decennia is het succes van dit model verder voortgestuwd door zijn ontvankelijkheid voor grootschalige mutagenese schermen en door het gemak van transgenese. Meer recent zijn gen-editing benaderingen van de kracht van het model uitgebreid.
Voor neurologische studies, de zebravis embryo en larven kunnen dus model waaraan meerdere methoden kunnen worden toegepast. Hier richten we ons op methoden die de studie van een essentiële eigenschap van neuronen, elektrische prikkelbaarheid mogelijk te maken. De voorbereiding van de elektrofysiologische studie van zebravis spinale neuronen omvat het gebruik van lijm dierenarts hechting aan het preparaat een opnamekamer garanderen. Alternatieve methoden voor het opnemenvan zebravis embryo's en larven omvatten de hechting van het preparaat aan de kamer met een fijne wolfraamstift 1, 2, 3, 4, 5. Een wolfraamstift wordt meestal gebruikt om het preparaat in een zijdelingse richting zet, al is gebruikt om larven dorsale zijde omhoog 4 monteren. De hechting lijm is gebruikt om embryo's en larven in beide richtingen te monteren. Gebruik van de lijm kan een minimale dissectie worden uitgevoerd, waardoor de toegang tot spinale neuronen zonder toepassing van een enzymatische behandeling, waardoor schade geen vermijden. Voor larven, is het noodzakelijk een korte enzymbehandeling toepassing op het spierweefsel rond het ruggenmerg verwijderd. De hier beschreven methoden zijn toegepast om de intrinsieke elektrische eigenschappen van motorneuronen, interneuronen en sensorische neuronen op verschillende developmentà bestuderenl trappen 6, 7, 8, 9.
George Streisinger pionier in het gebruik van Danio rerio, beter bekend als de zebravis als een modelsysteem voor de genetische analyse van gewervelde ontwikkeling 10. Het model biedt verscheidene voordelen waaronder: (1) betrekkelijk eenvoudige en goedkope veeteelt; (2) externe bevruchting, waardoor u gemakkelijk toegang tot de embryo's uit de vroegste ontwikkelingsfasen; en (3) een transparante embryo, die rechtstreeks en herhaalde waarnemingen van cellen, weefsels en organen zij vormen.
In de daaropvolgende decennia verschillende ontwikkelingen verder vergroot de kracht van de zebravis model. In het bijzonder naar voren genetische screens en hele genoom sequencing inspanningen speelden een belangrijke rol in de identificatie van mutaties en genen van cruciaal belang voor vele ontwikkelingsprocessen 11, 12, 13, 14,"> 15 16. Gateway klonering werkwijzen kon de routinematige toepassing van transgene benaderingen 17, 18. Recente vooruitgang in genoom uitgeven, met als voorbeeld transcriptie-activator-achtige (Talens) en geclusterde regelmatige afstand van elkaar korte palindroom herhalingen (CRISPR) -Cas9 nucleasen, zorgen voor de beoogde invoering van mutaties, evenals knock-out en knock-in benadert 19, 20, 21, 22. Gecombineerd, deze methoden maken zebravis een krachtig model voor de studie van de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan specifieke gedragingen en verschillende ziekten bij de mens 23, 24, 25, 26, 27.
Dit werk richt zich op de ontwikkeling vanmentale regelgeving en de rol van de elektrische activiteit in neuronale ontwikkeling. De nadruk ligt op het ruggenmerg, waarbij de zebravismodel verschaft verscheidene voordelen. Ten eerste is het relatief eenvoudig om toegang te krijgen tot de zebravis op de embryonale en larvale stadia; Daarom kan men ruggenmerg functie te bestuderen tijdens ontwikkelingsstadia die minder neuronen en eenvoudigere circuits 28, 29 hebben. Bovendien is de zebravis ruggenmerg heeft een diverse set van neuronen, vergelijkbaar met andere gewervelde dieren, zoals gedemonstreerd door karakteristieke en kenmerkende patronen van transcriptiefactoren 30, 31, 32, 33, 34, 35.
De meeste studies in zebravis die gericht zijn op de mechanismen die de functie van het ruggenmerg ten grondslag liggen bloot circuits, met nameDegenen die voortbeweging ondersteunen, zijn begrijpelijkerwijs gericht op larvale stadia 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Veel van de neuronen die het ruggenmerg loc netwerken vormen initiëren hun differentiatie in vroege embryonale stadia ~ 9-10 uur na bevruchting (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Met het oog hierop, begrijpen hoe de morfologische en elektrische eigenschappen van spinale neuronen ontstaan en verandering tussen de embryonale en larvale stadia is belangrijk voor een overall kennis van de vorming en functie bewegingsapparaat circuit.
De dissectie hier beschreven methoden mogelijk patch clamp opnamen van spinale neuronen en met succes toegepast op embryonale stadia (~ 17-48 HPF) en larvale stadia (~ 3-7 dagen na de bevruchting [DPF]). Deze aanpak beperkt de hoeveelheid dissectie die nodig is om de toegang tot de neuronen van belang. Het protocol verschilt van de meeste andere gepubliceerde methoden voor het registreren van zebravis spinale neuronen doordat dierenarts hechting lijm wordt toegepast, in plaats van een fijne wolfraamstift, het embryo of larven hechten aan de registratiekamer. De beschikbaarheid van twee verschillende benaderingen (dwz hechtdraad lijm ten opzichte van de wolfraam pin) voor het monteren van de zebravis embryo's of larven voor elektrofysiologische analyse geeft onderzoekers met alternatieve mogelijkheden om hun specifieke experimentele doelen te bereiken.
Ten eerste, de procedures voor het openen en het opnemen van een pop ulatie primaire sensorische neuronen, Rohon Beard-cellen beschreven. De cellichamen van deze neuronen liggen in de dorsale ruggenmerg. Rohon-Beard cellen bestaan in diverse gewervelde species, differentiëren vroeg in de ontwikkeling en ten grondslag aan de embryonale aanslagreactie 6, 44, 47, 48.
Ten tweede, procedures voor het openen en het opnemen van spinale motorische neuronen gedetailleerd. Zebravis spinale motorische neuronen voordoen bij twee golven van neurogenese. De eerder geboren primaire motorische neuronen ontstaan eind van gastrulatie (~ 9-16 HPF), met slechts 3-4 primaire motorische neuronen onderhavige per hemisegment 45, 46, 49. Daarentegen De latere populatie van secundaire motorische neuronen talrijker en ontstaat gedurende langere tijd, te beginnen bij ~ 14 HPFef "> 45 50. secundaire motor neuron genesis midden bundelsegmenten wordt meestal afgesloten met 51 HPF 50. Secundaire motorneuronen worden beschouwd als de tegenhanger van motorneuronen in amnioten zijn 46. Interessant supraspinale neuronen, via dopamine reguleren motoriek in de larve en secundaire motor neuron ontstaan in het embryo en jonge larven 50, 51. Primaire en secundaire motorische neuronen bevatten elk verschillende subtypes. elke primaire motorische neuron subtype projecteert een perifere axon dat een kenmerk spiergroep innerveert, leidt tot een stereotype, identificeren axonale traject. In het algemeen, secundaire motorneuronen volgen axonale trajecten eerder bij primaire motorische neuronen. Aldus opzichte van axonale trajecten, primaire en secundaire motorische neuronen vergelijkbaar, behalve dat axonale dikte en grootte een somatare groter voor primaire motorische neuronen 45.
Ten derde, werkwijzen voor het opnemen van enkele soorten interneuronen besproken. In deze gevallen beperkt verwijdering van andere ruggenmerg cellen is vereist, om zo het ruggenmerg meer intact dan bij opnamen van Rohon-Beard cellen of motorneuronen.
De hier beschreven werkwijzen maken de elektrische en morfologische karakterisering van sensorische en motorische neuronen van zebravis embryo's na een minimale dissectie van het ruggenmerg. Neuronen gezond blijven gedurende ten minste 1 uur, de tijdslimiet opgelegd aan deze opnames. Neuronen werden opgenomen met de standaard whole-cell configuratie, alsmede uit kernhoudende pleisters; deze methode kunnen space-clamp problemen die een gedetailleerde studie van biofysische ionenstromen 9 kunne…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (F32 NS059120 naar RLM en R01NS25217 en P30NS048154 te ABR).
Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | ||
Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | ||
Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | |
a-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | ||
Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | ||
Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye | |
Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | ||
Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | ||
Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer | |
Petri dishes | Falcon | 351029 | ||
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) | |
Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | ||
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | ||
Collagenase XI | Sigma | C7657 | ||
Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | ||
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | ||
Head stage | Molecular Devices | CV203BU | ||
Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | ||
Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) | |
Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | ||
Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | ||
Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | ||
Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | ||
40x/0.80w Achroplan objective | Zeiss | |||
Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 – Clampex and Clampfit | ||
Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | ||
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar | |
Dissection and Recording Solutions(in mM) | ||||
All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 – 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | ||||
The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20°C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | ||||
Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | |||
Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | |||
Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | |||
Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 µl) and store at -20°C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | |||
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar | |
Immobilizing agents | ||||
0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris | |||
Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20°C. | ||||
For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media | ||||
250 μM α-bungarotoxin | Prepare a 250 μM stock in ddH2O (1 mg/500 μl), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C. | |||
For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | ||||
1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C. | |||
For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. |