توضح هذه المخطوطة طرق التسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية في العمود الفقري من الأجنة الزرد واليرقات. إعداد يحافظ على الخلايا العصبية في الموقع وغالبا ما ينطوي على الحد الأدنى تشريح. تسمح هذه الطرق لدراسة الكهربية من مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية في العمود الفقري، من الأولي للاكتساب استثارة الكهربائية من خلال مراحل اليرقات في وقت مبكر.
اكتسبت الزرد، لأول مرة كنموذج تنموي، شعبية في العديد من المجالات الأخرى. سهولة تربية أعداد كبيرة من الكائنات الحية التي تشهد نموا سريعا، جنبا إلى جنب مع وضوح بصري الجنينية، بمثابة سمات مقنعة الأولى من هذا النموذج. على مدى العقدين الماضيين، فإن نجاح هذا النموذج قد دفعت مزيدا من بقدراتها على شاشات الطفرات على نطاق واسع وسهولة transgenesis. وفي الآونة الأخيرة، والنهج الجينات التحرير قمنا بمد قوة النموذج.
الدراسات النمائية العصبية، الجنين الزرد واليرقات نموذجا التي أساليب متعددة يمكن تطبيقها. هنا، ونحن نركز على الطرق التي تسمح للدراسة خاصية أساسية من الخلايا العصبية، استثارة الكهربائية. لدينا استعدادا للدراسة الكهربية للخلايا العصبية في العمود الفقري الزرد ينطوي على استخدام الغراء البيطري خياطة لضمان إعداد لغرفة تسجيل. طرق بديلة للتسجيلمن الأجنة الزرد واليرقات إشراك مرفق إعداد للغرفة باستخدام التنغستن دبوس غرامة 1، 2، 3، 4، 5. غالبا ما يتم استخدام دبوس التنغستن لتركيب إعداد في اتجاه جانبي، على الرغم من أنها قد استخدمت لجبل اليرقات الجانب الظهري 4. وقد استخدمت الغراء خياطة لتركيب الأجنة واليرقات في كل الاتجاهات. باستخدام الغراء، وتشريح الحد الأدنى لا يمكن أن يؤديها، مما يتيح الوصول إلى الخلايا العصبية في العمود الفقري من دون استخدام علاج الأنزيمية، وبالتالي تجنب أي ضرر الناتجة. ومع ذلك، ليرقات، فمن الضروري تطبيق العلاج انزيم قصيرة لإزالة الأنسجة العضلية المحيطة الحبل الشوكي. وقد استخدمت الأساليب المذكورة هنا لدراسة الخصائص الكهربائية الجوهرية من الخلايا العصبية الحركية، interneurons، والخلايا العصبية الحسية في العديد من developmentaل مراحل 6 و 7 و 8 و 9.
جيورج سترايزينغر رائدة في استخدام دانيو rerio، المعروف باسم الزرد، كنظام نموذج لتحليل الجيني للتنمية الفقاريات 10. ويقدم النموذج العديد من المزايا بما في ذلك: (1) بسيطة نسبيا وغير مكلفة تربية الحيوان؛ (2) الإخصاب الخارجي، مما يتيح سهولة الوصول إلى الأجنة من المراحل التنموية. و (3) الجنين شفافة، والسماح الملاحظات المباشرة والمتكررة من الخلايا والأنسجة والأعضاء لأنها تشكل.
على مدى العقود التي تلت ذلك، العديد من التطورات زادت زيادة قوة نموذج الزرد. على وجه الخصوص، شاشات الوراثية إلى الأمام وجهود تسلسل كامل الجينوم لعبت دورا رئيسيا في تحديد الطفرات والجينات الهامة لكثير من العمليات التنموية 11، 12، 13، 14،"> 15 طرق الاستنساخ 16. بوابة سمحت التطبيق الروتيني للالمعدلة وراثيا النهج 17 و 18. التطورات الحديثة في تحرير الجينوم، ومن أمثلته النسخ المنشط مثل (TALENs) وتجميع يكرر interspaced بانتظام قصيرة المتناوب (كريسبر) -Cas9 nucleases، النهج سماح لإدخال المستهدفة من الطفرات، فضلا عن خروج المغلوب واضعا في 19 و 20 و 21 و 22. المشتركة، وهذه الأساليب تجعل الزرد نموذجا قويا لدراسة الآليات الوراثية الكامنة وراء السلوكيات محددة والعديد من الأمراض التي تصيب الإنسان 23، 24، 25، 26، 27.
يركز هذا العمل على تطويرالتنظيم العقلي ودور النشاط الكهربائي في تطوير الخلايا العصبية. وينصب التركيز على الحبل الشوكي، والذي نموذج الزرد يوفر العديد من المزايا. أولا، فمن السهل نسبيا للوصول الزرد في المراحل الجنينية واليرقات. وبالتالي، يمكن للمرء أن دراسة وظيفة الحبل الشوكي أثناء مراحل النمو التي لديها عدد أقل من الخلايا العصبية وأبسط الدوائر +28، 29 عاما. وعلاوة على ذلك، والحبل الشوكي الزرد لديه مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية، على غرار الفقاريات الأخرى، كما يتضح من أنماط مميزة والمميزة لعوامل النسخ 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35.
غالبية الدراسات في الزرد التي تهدف إلى الكشف عن الآليات التي تكمن وراء وظيفة الدوائر الحبل الشوكي، وخاصةتلك التي تدعم الحركة، وتركز مفهوم على مراحل اليرقات 36، 37، 38، 39، 40، 41، 42، 43. ومع ذلك، فإن العديد من الخلايا العصبية التي تشكل شبكات قاطرة العمود الفقري بدء المفاضلة الخاصة بهم في المراحل الجنينية المبكرة، ~ 9-10 ساعة بعد الإخصاب (HPF) 44، 45، 46، 47، 48، 49، 50، 51. في ضوء ذلك، فهم كيف تنشأ الخصائص المورفولوجية والكهربائية للخلايا العصبية في العمود الفقري والتغيير بين المراحل الجنينية واليرقات مهمة لoveraفهم ليرة لبنانية من تشكيل الدائرة الحركي وظيفة.
طرق تشريح الموصوفة هنا تسمح التسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في العمود الفقري كما تم تطبيقها بنجاح في المراحل الجنينية (~ 17-48 HPF) ومراحل اليرقات (~ 3-7 أيام بعد الإخصاب [DPF]). هذا النهج يحد من كمية تشريح المطلوبة لتوفير الوصول إلى الخلايا العصبية في المصالح. يختلف البروتوكول من غالبية الطرق الأخرى المنشورة لتسجيل من الخلايا العصبية في العمود الفقري الزرد في هذا الغراء البيطري خياطة يستخدم بدلا من دبوس التنغستن على ما يرام، لنعلق الجنين أو يرقة إلى غرفة تسجيل. توافر نهجين مختلفين (أي خاط الغراء مقابل دبوس التنجستن) لتركيب الأجنة الزرد أو اليرقات لتحليل الكهربية يوفر للباحثين خيارات بديلة لتحقيق الأهداف التجريبية الخاصة.
أولا، إجراءات الوصول والتسجيل من البوب ulation من الخلايا العصبية الحسية الأولية، والخلايا روهون اللحية، موصوفة. تكمن الهيئات خلية من هذه الخلايا العصبية في النخاع الشوكي الظهري. وتوجد الخلايا روهون اللحية في العديد من أنواع الفقاريات، تفرق في التنمية في وقت مبكر، وتكمن وراء استجابة اللمس الجنينية 6، 44، 47، 48.
ثانيا، إجراءات للوصول إلى وتسجيل من الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري مفصلة. تنشأ الزرد الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري خلال موجتين من الخلايا العصبية. تنشأ الخلايا العصبية الحركية الأولية في وقت سابق المولد في نهاية المعيدة (~ 9-16 HPF)، مع الخلايا العصبية الحركية الأساسي فقط 3-4 الحالية في hemisegment 45 و 46 و 49. في المقابل، فإن السكان المولودين في وقت لاحق من الخلايا العصبية الحركية الثانوية هو أكثر عددا وتنشأ خلال فترة طويلة، ابتداء من الساعة 14 HPF ~EF "> 45، 50. نشأة الخلايا العصبية الحركية الثانوية في قطاعات منتصف جذع اكتمال معظمها بنسبة 51 HPF 50. وتعتبر الخلايا العصبية الحركية الثانوية لتكون النظير من الخلايا العصبية الحركية في amniotes 46. ومن المثير للاهتمام، الخلايا العصبية فوق الشوك، عن طريق الدوبامين، وتنظيم الحركة في اليرقة والحركية الثانوي الخلايا العصبية نشأة في الجنين ويرقة الشباب 50 و 51. الخلايا العصبية الحركية الأولية والثانوية تضم كل منها عدة أنواع فرعية مختلفة. كل محرك الأساسي مشاريع الخلايا العصبية النوع الفرعي محور عصبي محيطي أن يعصب مجموعة العضلات مميزة، مما أدى إلى النمطية، تحديد مسار المحاور. عموما، الخلايا العصبية الحركية الثانوية تتبع مسارات محور عصبي أنشئت من قبل الخلايا العصبية الحركية الأساسية. وهكذا، وفيما يتعلق مسارات محور عصبي، الخلايا العصبية الحركية الأساسية والثانوية متشابهة، باستثناء أن سمك المحاور وsomata حجم لإعادة أكبر للالخلايا العصبية الحركية الأولية 45.
ثالثا، وتناقش طرق للتسجيل من أنواع قليلة من interneurons. ومع ذلك، في هذه الحالات، لا بد من كمية محدودة من إزالة خلايا النخاع الشوكي أخرى، وبالتالي فإن الحبل الشوكي هو أقل سليمة من التسجيلات من خلايا روهون اللحية أو الخلايا العصبية الحركية.
الأساليب المذكورة هنا تسمح لتوصيف الكهربائية والمورفولوجية من الخلايا العصبية الحسية والحركية من الأجنة الزرد بعد تشريح الحد الأدنى من الحبل الشوكي. تبقى الخلايا العصبية السليمة لا يقل عن 1 ساعة، والمهلة الزمنية المفروضة على هذه التسجيلات. وقد سجلت الخلايا العصبية…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (F32 NS059120 إلى RLM وR01NS25217 وP30NS048154 إلى ABR).
Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | ||
Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | ||
Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | |
a-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | ||
Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | ||
Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye | |
Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | ||
Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | ||
Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer | |
Petri dishes | Falcon | 351029 | ||
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) | |
Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | ||
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | ||
Collagenase XI | Sigma | C7657 | ||
Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | ||
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | ||
Head stage | Molecular Devices | CV203BU | ||
Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | ||
Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) | |
Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | ||
Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | ||
Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | ||
Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | ||
40x/0.80w Achroplan objective | Zeiss | |||
Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 – Clampex and Clampfit | ||
Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | ||
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar | |
Dissection and Recording Solutions(in mM) | ||||
All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 – 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | ||||
The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20°C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | ||||
Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | |||
Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | |||
Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | |||
Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 µl) and store at -20°C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | |||
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar | |
Immobilizing agents | ||||
0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris | |||
Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20°C. | ||||
For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media | ||||
250 μM α-bungarotoxin | Prepare a 250 μM stock in ddH2O (1 mg/500 μl), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C. | |||
For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | ||||
1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C. | |||
For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. |