Reifung von humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in Biowires Verwendung elektrischer Stimulation
Özet
Die kardiale biowire Plattform ist eine in vitro – Methode verwendet , um durch die Kombination von dreidimensionaler Zellkultivierung mit elektrischer Stimulation humanen embryonale und induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (HPSC-CM) zu reifen. Dieses Manuskript zeigt den detaillierten Aufbau der Herzens biowire Plattform.
Abstract
Humanen pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (HPSC-CMs) haben eine viel versprechende Zellquelle und haben ermutigt, so die Untersuchung ihrer möglichen Anwendungen in der Herzforschung, einschließlich der Wirkstoffforschung, Krankheitsmodelle, Tissue Engineering und der regenerativen Medizin. Jedoch durch bestehende Protokolle produzierten Zellen zeigen eine Reihe von Unreife verglichen mit nativem Erwachsenen Kardiomyozyten. Viele Anstrengungen wurden unternommen, HPSC-CMs, mit nur mäßiger Reifung erreicht so weit zu reifen. Daher ist es ein engineered System, genannt biowire, wurde durch die Bereitstellung sowohl physikalische als auch elektrische Signale entwickelt HPSC-CMs zu einem reiferen Zustand in vitro zu führen. Das System verwendet eine mikrofabrizierte Plattform HPSC-CMs in Kollagen Typ I entlang einer Naht starren Schablone gelieren zusammen in fluchtHerzGewebe (biowire) Samen, die mit einer progressiv ansteigenden Frequenz der elektrischen Feldstimulierung ausgesetzt wird. Im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollen,stimulierte biowired einen verbesserten Reifegrad strukturellen und elektro Kardiomyozyten zeigen. Solche Änderungen sind abhängig von der Stimulationsrate. Dieses Manuskript beschreibt ausführlich die Gestaltung und Erstellung von biowires.
Introduction
Zell-basierte Therapie ist eine der vielversprechendsten und untersuchten Strategien Herz-Reparatur / Regeneration zu erreichen. Es wurde von Herz-Tissue Engineering und der Co-Lieferung von Biomaterialien 1, 2 unterstützt. Die meisten verfügbaren Zellquellen haben in Tiermodellen für ihre potenziell positiven Auswirkungen auf beschädigt, krank oder im Alter von Herzen 3 untersucht worden. Insbesondere haben erhebliche Anstrengungen humanen pluripotenten Stammzellen (HPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten (HPSC-CM), eine potentiell unbegrenzte autologe Zellquelle für Herz-Tissue Engineering verwenden gemacht worden. HPSC-CMs kann mit mehreren etablierten Protokollen 4 hergestellt werden, 5, 6. Die erhaltenen Zellen fötale artige Phänotypen darstellen, mit einer Reihe von unreifen Eigenschaften im Vergleich zu erwachsenem ventrikulären Kardiomyocyten jedoch, 7, </sup> 8. Dies kann ein Hindernis für die Anwendung von HPSC-CMs als Modelle von adulten Herzgeweben in der Wirkstoffforschung und in der Entwicklung von adulten Herzkrankheitsmodellen 9 sein.
Um diese Einschränkung der phänotypischen Unreife zu überwinden, werden neue Ansätze wurden Kardiomyozyten Reifung zu fördern aktiv untersucht. Frühe Studien zeigten wirksame pro-Reifungseigenschaften in neonatalen Ratten – Kardiomyozyten über zyklische mechanische oder elektrische Stimulation 10 11. Gel Kompaktierung und zyklische mechanische Stimulation wurden ebenfalls 12 einige Aspekte der HPSC-CM Reifung verbessern gezeigt, 13, mit minimaler Verstärkung der elektrophysiologischen und Calcium Handhabungseigenschaften. Daher wurde durch die Bereitstellung sowohl strukturelle Cues und elektrisches Feld stimulatio ein Plattformsystem „biologische wire“ (biowire) genannt erdachtn die Reifung von HPSC-CMs 14 zu verbessern. Dieses System verwendet eine mikrofabrizierte Plattform ausgerichtet Herzgewebe zu schaffen, das auf elektrische Feldstimulation zugänglich ist. Dies kann dazu verwendet werden, um die strukturelle und elektroLaufZeit von HPSC-CMs zu verbessern. Hier beschreiben wir die Einzelheiten einer solchen biowires machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript beschreibt die Einrichtung und Durchführung der konstruierten Plattform, biowire, die Reifung von HPSC-CMs zu verbessern. Das Gerät kann in Standard-Mikrofabrikationsanlagen hergestellt werden und kann mit biowires gemeinsamen Zellkulturtechniken und einem elektrischen Stimulator erzeugt werden.
Unseres Wissens gibt es keine berichtete ähnliches Verfahren wie biowires. Diese Strategie zeigt, dass eine verbesserte Reifungseigenschaften auf der elektrischen Stimulationsreg…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss-in-Hilfe unterstützt von der Herz-und Schlaganfall-Stiftung Kanada (G-14-0006265), Betriebskostenzuschüsse von der kanadischen Institutes of Health Research (137352 und 143066) und einem JP Bickell Gründungszuschuss (1.013.821 ) zu SSN.
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
Referanslar
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
